反轉(zhuǎn)錄PCR-步驟和方法

1、反轉(zhuǎn)錄PCR科技名詞定義中文名稱:反轉(zhuǎn)錄PCR英文名稱:reverse transcription PCR;RT-PCR定義:擴增mRNA的一種實驗技術(shù)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再以 cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。應(yīng)用學科:遺傳學(一級學科)；基因組學(二級學科)以上內(nèi)容由全國科學技術(shù)名詞審定委員會審定公布目錄一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇二、合成cDNA弓|物的選擇三、操作步驟 四、注意事項mRMa CD<»Ar Svpef RnaseW 由秘加 ifyrsc Iranwnpase'tt tRT-PCR反應(yīng)原理1反轉(zhuǎn)錄 PCR ( Reverse Transcr

2、iption-Polymerase Chain Reaction. RT- PCR) 乂稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA,以其中 的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNAo再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。 RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品 分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合 成 cDNA 探針、構(gòu)建 RNA 高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。RT- PCR (Reverse Transcription- Polymerase3Chain Reac

3、tion)即逆轉(zhuǎn)錄PCR,是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合 酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可 用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特 定基因的cDNA序列等。編輯人口一、 反轉(zhuǎn)錄酶的選擇1. Money鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性， RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37。2. 禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶 H活性。最適作用溫度為42。3. Thermus thermophilus> Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反 轉(zhuǎn)錄酶：在

4、Mn2存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,以消除RNA模板的二級結(jié) 構(gòu)。4. MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript和 SuperScriptll o此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,這一 特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。編輯木段二、 合成cDNA引物的選擇1 .隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而 難于拷貝其全長序列時.，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全 長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了 cDNA第一鏈模 板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異

5、性。通常用此引物合成的cDNA 中96%來源于rRNAo2 . Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞 mRNA具有才端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于 Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作 為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。3 .特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核 甘酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與 mRNA 3,端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA,導(dǎo)致 更為特異的PCR擴增。三、 操作步驟1. 總

6、RNA的提取。2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription ）：目前試劑公司有多種 cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒為例。（1）在微量離心管中，加入總RNA補充適量的DEPC H20使總體積達11阿。在管中加10pM Oligo （dT） 12-18 13,輕輕混勻、離心。（2） 70加熱lOmin,立即將微量離心管插入冰浴中至少lmin。然后加入下列試劑的混合物：lO

7、xPCR buffer 2Hl25mM MgCl2 2HllOmM dNTPmix lplDTT 2 Hl輕輕混勻,離心。42孵育25min,（3 ）加入 SuperscriptIllpd，在 42水浴中孵育 50min。（4）于70加熱15min以終止反應(yīng)。（5）將管插入冰中，加入RNase Hlpd, 37孵育20min,降解殘留的 RNA。20保存?zhèn)溆谩?. PCR：（1）取PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA 2Hl上游引物（10pM） 2Hl下游引物（10pM） 2HldNTP（2mM） 4HllOxPCR buffer 5HlTaq 酶（2u/pil） Ipl（2）加入適量

8、的ddH20,使總體積達504。輕輕混勻，離心。（3）設(shè)定PCR程序。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保 證實驗結(jié)果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如 G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA,作為對照。（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。（5）密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行 密度掃描。爾川本段四、注意事項1 .在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA 的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。2 .為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照。3 .內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、p-Actin （由肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA 定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差 等所造成的誤差。4 . PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度