愈傷組織培養(yǎng)精講

1、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)第第2 2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)12018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)第第2 2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：?愈傷組織的誘導(dǎo)與分化愈傷組織的誘導(dǎo)與分化?愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織的繼代培養(yǎng)?愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生? 不定芽和根的發(fā)生不定芽和根的發(fā)生?體細(xì)胞胚的發(fā)生體細(xì)胞胚的發(fā)生?愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用22018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)本章教學(xué)目的與要求本章教學(xué)目的與要求?1、了解愈傷組織細(xì)胞分化的各時(shí)期的特點(diǎn)、了解愈傷組織細(xì)胞分化的各時(shí)期的特點(diǎn)2、掌握植物激素控制理

2、論、掌握植物激素控制理論3、掌握愈傷組織的形態(tài)發(fā)生、掌握愈傷組織的形態(tài)發(fā)生4、區(qū)別胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形、區(qū)別胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株成植株5、愈傷組織培養(yǎng)在園藝植物育種中的應(yīng)用、愈傷組織培養(yǎng)在園藝植物育種中的應(yīng)用32018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)(callus culture)?定義定義:是指將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在是指將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在激素作用下，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和分激素作用下，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和分化的培養(yǎng)過程?；呐囵B(yǎng)過程。42018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)第一節(jié)第一節(jié)

3、愈傷組織的誘導(dǎo)和分化愈傷組織的誘導(dǎo)和分化一一 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)?誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件，其，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。中激素的成分和濃度是最重要的因素。52018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Callus arising from vascular tissueCallus arising from leaf tissue6From rootFrom embryo culture2018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Photo indicating where th

4、e callus (c) arises from72018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化二愈傷組織的分化二愈傷組織的分化?從外植體脫分化形成從外植體脫分化形成愈傷組織分化愈傷組織分化典型的典型的愈傷組織大致愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：可分為三個(gè)時(shí)期：誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期分裂期分裂期分化期分化期82018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Stage 1. Induction（誘導(dǎo)期）（誘導(dǎo)期）:細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期，是愈傷組織形成起點(diǎn)。細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期，是愈傷組織形成起點(diǎn)。92018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘

5、導(dǎo)和分化誘導(dǎo)期細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化誘導(dǎo)期細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化氣體交換增加，如氧氣的吸收增加氣體交換增加，如氧氣的吸收增加RNA含量增加（增加到含量增加（增加到300%）蛋白質(zhì)量增加（每個(gè)細(xì)胞的總增加量為蛋白質(zhì)量增加（每個(gè)細(xì)胞的總增加量為200%）酶活性增強(qiáng)酶活性增強(qiáng)102018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Stage 2. Cell division 分裂期分裂期指外植體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，不斷分裂、指外植體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。增生子細(xì)胞的過程。112018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn)分裂期細(xì)

6、胞的主要表現(xiàn):1.1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。2.2.每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。3.3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。4 4細(xì)胞的核和核仁增大到最大。細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.5.細(xì)胞中細(xì)胞中RNARNA含量減少，而含量減少，而DNADNA含量保持不變。含量保持不變。6.6. 隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。122018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化分裂期愈傷組織的共同特征：分裂期愈傷組織的

7、共同特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。1mg/l 2,4-D10mg/l 2,4-D132018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Stage 3. Differentiation 分化期分化期指愈傷組織細(xì)胞停止分指愈傷組織細(xì)胞停止分裂，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列形裂，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)和生理上的變化態(tài)和生理上的變化 , ,形成一形成一些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞的時(shí)期。的時(shí)期。142018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的

8、誘導(dǎo)和分化分化期細(xì)胞特點(diǎn)：分化期細(xì)胞特點(diǎn)：A AB BC CD D細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：形成瘤狀或片狀的形成瘤狀或片狀的分生組織結(jié)節(jié)分生組織結(jié)節(jié)?；?。或維管組織結(jié)節(jié)。維管組織結(jié)節(jié)。細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少。細(xì)胞的體積相對(duì)穩(wěn)定，不再減少。出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。E E 生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。152018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘

9、導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Callus types：根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：Rhizogenic callusCallus exuding sticky Friable易碎易碎生根的愈傷生根的愈傷poly-saccharides滲出粘性多糖的愈傷滲出粘性多糖的愈傷Hard / lignified callus162018/10/8第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化Callus may have a yellow, white, green or red (anthocyanin 花青苷花青苷) appearance. 不同顏色的愈傷不同顏色的愈傷172

10、018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織的繼代培養(yǎng)1 1、定義：定義：培養(yǎng)物在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間培養(yǎng)物在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng), ,這個(gè)過程叫做這個(gè)過程叫做繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)。182018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)2、愈傷組織培養(yǎng)的調(diào)控因素：、愈傷組織培養(yǎng)的調(diào)控因素：外植體外植體培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境192018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二

11、節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)（一）材料本身（一）材料本身遺傳型遺傳型外植體外植體年齡年齡器官和部位器官和部位202018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)（二）培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基1 1無機(jī)營養(yǎng)無機(jī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的 N N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，對(duì)細(xì)胞，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，對(duì)細(xì)胞分化起重要作用。分化起重要作用。2 2植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)一般使用的濃度為一般使用的濃度為 0.1-10mg0.1-10mgL L。使用植物生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，要注意使用植物生長調(diào)節(jié)劑時(shí)，要注意 種類和濃度種類和濃度，特別是生長素和細(xì)胞分裂素的比值。特別是生長素和細(xì)胞分裂素的比值。2018/10/

12、8?21第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)器官分化的植物激素控制理論器官分化的植物激素控制理論 (激素配比模式激素配比模式)?生長素與細(xì)胞分裂素的比值是根和芽形成的控生長素與細(xì)胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發(fā)育的方向制條件，決定著發(fā)育的方向: :是愈傷組織、長是愈傷組織、長根還是長芽。根還是長芽。高高利于根的形成利于根的形成適中適中 利于愈傷組織的形成利于愈傷組織的形成低低利于芽的形成利于芽的形成生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素222018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織分化愈傷組織分化232018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培

13、養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)3有機(jī)成分有機(jī)成分培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入 糖、各類糖、各類B B族維生素、肌醇和甘氨族維生素、肌醇和甘氨酸酸等，等，可滿足愈傷組織生長和分化的要求可滿足愈傷組織生長和分化的要求 。各種各種氨基酸和嘌呤、嘧啶類物質(zhì)氨基酸和嘌呤、嘧啶類物質(zhì)，可促進(jìn)器官可促進(jìn)器官分化。分化。水解酪蛋白水解酪蛋白中含有多種氨基酸，中含有多種氨基酸， 助于器官分化助于器官分化酰胺類酰胺類往往有往往有促進(jìn)器官形成促進(jìn)器官形成的作用。的作用。242018/10/8第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)4.培養(yǎng)方式：培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)252018/10/8第二節(jié)愈

14、傷組織的繼代培養(yǎng)第二節(jié)愈傷組織的繼代培養(yǎng)（三）培養(yǎng)條件（三）培養(yǎng)條件光照光照溫度溫度光強(qiáng)、光照時(shí)間、光質(zhì)光強(qiáng)、光照時(shí)間、光質(zhì)24-28262018/10/8第第2章章 愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生?形態(tài)建成形態(tài)建成：外植體細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件：外植體細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。27魔芋胚狀體魔芋胚狀體2018/10/8小麥愈傷組織小麥愈傷組織第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織

15、的形態(tài)發(fā)生方式: :不定芽方式不定芽方式胚狀體方式胚狀體方式282018/10/8愈傷組織類型及特征愈傷組織類型及特征?結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立胚性愈傷組織：具有產(chǎn)生胚狀體能力。292018/10/8第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生一、不定芽方式（一、不定芽方式（adventitious bud）外植體外植體脫分化脫分化愈傷組織愈傷組織高生長素高生長素(2,4-D)再分化再分化芽芽根根再生植株再生植株2018/10/8低低(生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素)高高(生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂

16、素)30第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：（1）愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，）愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，即無根的芽或無芽的根；即無根的芽或無芽的根；（2）先長芽，后長根，）先長芽，后長根， 多數(shù)情況多數(shù)情況；（3）先長根，再從根的基部長芽。這種情況）先長根，再從根的基部長芽。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對(duì)于單子葉植物；較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對(duì)于單子葉植物；（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株植株。芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一

17、株植株。312018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生小麥的形態(tài)發(fā)生小麥的形態(tài)發(fā)生愈傷組織愈傷組織試管苗試管苗再生苗再生苗芽分化芽分化322018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生二、胚狀體方式（二、胚狀體方式（somatic embryo）胚狀體（胚狀體（embryoid）：）：指在組織培指在組織培養(yǎng)中，由一個(gè)非合子細(xì)胞養(yǎng)中，由一個(gè)非合子細(xì)胞 ( (體細(xì)胞體細(xì)胞) )，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚子葉胚5 5個(gè)時(shí)期），形成具有雙極個(gè)時(shí)期），形成

18、具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。性的胚狀結(jié)構(gòu)。332018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生注意：體細(xì)胞胚注意：體細(xì)胞胚1、不同于合子胚、不同于合子胚2、不同于孤雌、不同于孤雌/雄胚雄胚3、不同于器官發(fā)生方式形成的幼苗、不同于器官發(fā)生方式形成的幼苗342018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生胚狀體與合子胚的比較胚狀體與合子胚的比較:合子胚合子胚質(zhì)量質(zhì)量來源來源胚柄胚柄形態(tài)形態(tài)萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率高，質(zhì)量好受精卵受精卵有，明顯有，明顯固定，體積相對(duì)較小固定，體積相對(duì)較小胚狀體胚狀體萌發(fā)率低，質(zhì)量差萌發(fā)率低，質(zhì)量差體細(xì)胞體細(xì)胞即使有也不明顯即使有也不明

19、顯復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子葉，體積較大葉，體積較大變異率變異率低低2018/10/8高高35第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株的過程：由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株的過程：脫脫外植體外植體分分化化愈傷組織愈傷組織胚狀體胚狀體再生植株再生植株362018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株的區(qū)別胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株的區(qū)別 :?胚狀體胚狀體具有兩極性具有兩極性，即有莖端和根端。，即有莖端和根端。胚狀體的胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。胚狀體胚狀體維管組織的分布是獨(dú)立的維管組織的分布是獨(dú)立的“ Y Y” 字形字形。372018/10/8第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點(diǎn)：胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點(diǎn)：?胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多；胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多；胚狀體可以制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；胚狀體可以制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。382018/10/8第四節(jié)第四節(jié) 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用第四節(jié)第四節(jié) 愈傷組織