T-RFLP技術(shù)在分子分析土壤細(xì)菌群落方面的應(yīng)用

1、Application of Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism for Molecular Analysis of Soil Bacterial Communities T-RFLP技術(shù)在分子分析土壤細(xì)菌群落方面的應(yīng)用技術(shù)在分子分析土壤細(xì)菌群落方面的應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容lT-RFLP簡介簡介l實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法lT-RFLP在土壤細(xì)菌群落其他方面的應(yīng)用在土壤細(xì)菌群落其他方面的應(yīng)用l結(jié)論結(jié)論1.T-RFLP簡介 T-RFLP是將目標(biāo)DNA片段的一個(gè)末端(通常是5端)用熒光標(biāo)記，這樣在酶切后，分析的目標(biāo)只限于有熒光標(biāo)記的末端限制性片段

2、上。酶切后產(chǎn)生長度不等的末端限制性長度片段經(jīng)過毛細(xì)管電泳分離，并經(jīng)ABI自動(dòng)測序儀上檢測和計(jì)算后，輸出末端限制性片段的大小和強(qiáng)度圖。測序儀上輸出的圖譜含有的不同波峰越多，則表明微生物種類越豐富。通過比較不同樣品圖譜間波峰的異同，可以為評(píng)估土壤微生物多樣性提供更敏感的數(shù)量化基礎(chǔ)，從而為比較土壤樣品之間的關(guān)系提供一種依據(jù)。Fig. 19.2 Examples of T-RFLP profiles obtained after HinfI digestion of amplified 16S rDNA from an agricultural soil (upper chromatogram) an

3、d a heavy-metal rich (serpentine) soil (lower chromatogram). Data Point indicates size range between 20 bp and 500 bp. F.I. Fluorescence intensity Fig. 19.1 Schematic representation of T-RFLP technique. T-RFLP原理圖原理圖2.實(shí)驗(yàn)方法2.1 PCR反應(yīng)體系 每個(gè)PCR反應(yīng)體系為50l包括：Taq DNA聚合酶稀釋緩沖液，1.5 mM MgCl2，10 mM dNTPs，2 units Ta

4、q DNA聚合酶，10 pmol各種引物，1020 ng模版DNA。 95保溫保溫 1.5 min 94變性變性 30 s 55退火退火 30 s 72延伸延伸 2 min 72最終延伸最終延伸 10 min 95保溫保溫 1.5 min 95保溫保溫 1.5 min94變性變性 30 s 94變性變性 30 s60退火退火 30 s 50退火退火 30 s 72延伸延伸 2 min 72延伸延伸 2 min72最終延伸最終延伸 10 min 72最終延伸最終延伸 10 min5個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)25個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)5個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)2.2 PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序 2.3 PCR產(chǎn)物檢測分析產(chǎn)物檢測分析瓊脂糖檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。專門的工具凈化擴(kuò)增產(chǎn)物。選擇性限制酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化。毛細(xì)管電泳分離消化后產(chǎn)物。2.4 實(shí)驗(yàn)問題分析T-RFLP條帶不亮或者16S rDNA擴(kuò)增很少 檢查模版DNA的數(shù)量和純度，檢查試劑和PCR反應(yīng)程序。條帶太多或者太少 結(jié)合分析不同的限制酶來排除問題。3.T-RFLP在土壤細(xì)菌群落其他方面的應(yīng)用在土壤細(xì)菌群落其他方面的應(yīng)用 T-RFLP可以用于細(xì)菌群落表征功能多樣性的研究。 T-RFLP也可以用于從土壤中提取RNA和遺傳多樣性的鑒別。 4.結(jié)論結(jié)論 l T-R