酶聯(lián)免疫吸附測定法ppt課件

1、酶聯(lián)免疫吸附測定法 生物體系中的化學(xué)丈量生物體系中的化學(xué)丈量裴丹青裴丹青0308115203081152 復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)丈量是提復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)丈量是提示生命奧妙的重要手段，在食品檢驗(yàn)、疾病診示生命奧妙的重要手段，在食品檢驗(yàn)、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。 經(jīng)典的化學(xué)分析方法滴定分析、分量分經(jīng)典的化學(xué)分析方法滴定分析、分量分析、簡單的吸光光度法是以簡單離子或分子析、簡單的吸光光度法是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件那么往

2、成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件那么往往無能為力。往無能為力。 于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的丈量方法應(yīng)運(yùn)而生。免疫化學(xué)分析即其重要成丈量方法應(yīng)運(yùn)而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供理為生命體系中高特異性、超微量的分析提供理處理方法。處理方法。 什么是什么是 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫分析技術(shù) ELISA ELISA的根本原理和方法的根本原理和方法 ELISA ELISA的種類和變化的種類和變化 ELISA ELISA的特點(diǎn)的特點(diǎn) ELIS

3、A ELISA的運(yùn)用實(shí)例的運(yùn)用實(shí)例 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)開展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA如今已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzymatic techniques ) 的根底上開展起來的一種新型的免疫測定技術(shù) 。 一、根本原理一、根本原理 它采用抗原與抗體的特異反響將待它采用抗原與抗體的特異反響將待測物

4、與酶銜接，然后經(jīng)過酶與底物產(chǎn)生測物與酶銜接，然后經(jīng)過酶與底物產(chǎn)生顏色反響，用于定量測定。測定的對象顏色反響，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原?？梢允强贵w也可以是抗原。在這種測定方法中有在這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑：固相的抗原或抗體免疫吸附劑固相的抗原或抗體免疫吸附劑酶標(biāo)志的抗原或抗體標(biāo)志物酶標(biāo)志的抗原或抗體標(biāo)志物酶作用的底物顯色劑酶作用的底物顯色劑 丈量時，抗原抗體先結(jié)合在固相載體上，丈量時，抗原抗體先結(jié)合在固相載體上，但仍保管其免疫活性，然后加一種抗體抗原但仍保管其免疫活性，然后加一種抗體抗原與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物標(biāo)志物，此偶聯(lián)物仍保與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物標(biāo)志物，

5、此偶聯(lián)物仍保管其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體管其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原抗體反響結(jié)合后，上的抗原抗體反響結(jié)合后，再加上酶再加上酶的相應(yīng)底的相應(yīng)底物，即起物，即起催化水解催化水解或氧化復(fù)或氧化復(fù)原反響而原反響而呈顏色。呈顏色。 其所生成的顏色深淺其所生成的顏色深淺與欲測的抗原抗體含與欲測的抗原抗體含量成正比。量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡察看，也可以用分光微鏡察看，也可以用分光光度計酶標(biāo)儀加以測光度計酶標(biāo)儀加以測定。定。 其方法簡單，方便訊其方法簡單，方便訊速，特異性強(qiáng)。速，特異性強(qiáng)。二、酶及其底物

6、二、酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, , 半抗原半抗原在交聯(lián)劑作用下結(jié)合的產(chǎn)物。是在交聯(lián)劑作用下結(jié)合的產(chǎn)物。是ELISAELISA成敗成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反響，還具有酶促反響，顯示出生物免疫反響，還具有酶促反響，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反響將得到不同的顏色反響. .酶酶 底底 物物顯色顯色反應(yīng)反應(yīng) 測定波長測定波長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-

7、2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍(lán)綠色藍(lán)綠色492492460460449449425425642642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍(lán)色深藍(lán)色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基

8、傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光黃色黃色 360,450360,450420420 ELISAELISA的種類和變化的種類和變化 一雙抗體夾心法一雙抗體夾心法二間接法二間接法三競爭法三競爭法 四雙位點(diǎn)一步法四雙位點(diǎn)一步法五捕獲法測五捕獲法測IgMIgM抗體抗體六運(yùn)用親和素和生物素的六運(yùn)用親和素和生物素的ELISA ELISA 一雙抗體夾心法一雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原獲得待分析物的未標(biāo)定抗體獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相將特異性抗體與固相

9、載體銜接構(gòu)成固相抗體載體銜接構(gòu)成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)抗體及雜質(zhì) 參與封鎖蛋白溶液以封鎖載體參與封鎖蛋白溶液以封鎖載體外表殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)外表殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的封鎖蛋白洗滌并除去未結(jié)合的封鎖蛋白加受檢標(biāo)本抗原構(gòu)成加受檢標(biāo)本抗原構(gòu)成固相抗體抗原復(fù)合物固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成加酶標(biāo)抗體生成抗體抗體待測抗原待測抗原酶標(biāo)志抗體酶標(biāo)志抗體的復(fù)合物的復(fù)合物 徹底洗滌徹底洗滌未結(jié)合的未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體 加底物進(jìn)展加底物進(jìn)展酶催化反響酶催化反響 根據(jù)顏色反響的根據(jù)顏色反響的程度進(jìn)展該抗原程度進(jìn)

10、展該抗原的定性或定量測定的定性或定量測定 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)志的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。二間接法二間接法包被固相載體包被固相載體: : 用知抗原包被用知抗原包被固相載體固相載體 加待檢標(biāo)本加待檢標(biāo)本: : 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗抗體加酶標(biāo)抗抗體: :與固相載體上抗原抗體與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體 加底物加底物顯色顯色 根據(jù)顏色反響的程度進(jìn)展根據(jù)顏色反響的程度進(jìn)展該抗原的定性或定量測定該抗原的定

11、性或定量測定三競爭法三競爭法 此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體于測定抗體 。用知特異性用知特異性抗體包被抗體包被固相載體固相載體 測定管加待測抗原和測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合固相抗體競爭結(jié)合 對看管只加一定量酶標(biāo)抗原對看管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌分別洗滌除去未結(jié)合除去未結(jié)合的成分的成分 加底物顯色加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對看管與測定管吸光度值之比，根據(jù)對看管與測定管吸光度值之比， 計算標(biāo)本中待測抗原含量計

12、算標(biāo)本中待測抗原含量 對看管由于只加酶標(biāo)抗原，與對看管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度那么隨待測抗深；測定管的顯色程度那么隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，參與底物后顯色反響較弱。參與底物后顯色反響較弱。 特點(diǎn)一：靈敏性特點(diǎn)一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告集團(tuán)的該測定法的靈敏度來自作為

13、報告集團(tuán)的酶。眾所周知酶。眾所周知, , 酶是一種有機(jī)催化劑，很少酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反響量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反響 ，產(chǎn)生可，產(chǎn)生可供察看的顯色反響景象。因此該體系常被稱供察看的顯色反響景象。因此該體系常被稱為酶放大體系。為酶放大體系。ELISAELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞程度上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在胞程度上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克程度上對其進(jìn)展定量。微克、甚至納克程度上對其進(jìn)展定量。 例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/m

14、l程度，酶反響程度，酶反響測定法的敏感度約為測定法的敏感度約為510g/ml 510g/ml 。 特點(diǎn)二：特異性特點(diǎn)二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性。其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合本質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原抗體的結(jié)合本質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決議簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。抗原決議簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型上呈互由于兩者在化學(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反響具有高度的補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反響具有高度的特異性。特異性。 例如乙肝病毒中的例如乙肝病毒中的外表抗原外表抗原HBsAgHBsAg、e e抗原抗原HBeAgHBeAg和中心抗和

15、中心抗體體HBcAgHBcAg，雖來源于，雖來源于同一病毒，但僅與其相同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反響?？沽硗鈨煞N抗體反響?？乖贵w反響的這種特異原抗體反響的這種特異性使免疫測定能在一非性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物例如血清中測定某例如血清中測定某一特定的物質(zhì)，而不需一特定的物質(zhì)，而不需先分別待檢物。先分別待檢物。ELISAELISA運(yùn)用實(shí)例運(yùn)用實(shí)例 飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測定主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素簡曲霉毒素 飼料中有害微生物的快速篩檢

16、飼料中有害微生物的快速篩檢 如沙門氏如沙門氏菌菌 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料平安檢測中的運(yùn)用在飼料平安檢測中的運(yùn)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測用于農(nóng)藥殘留的檢測河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松例如殺暝松 FN FN 、 甲氟磷酸異已酶甲氟磷酸異已酶 SOMAN SOMAN 、 草不綠草不綠 Alachor Alachor 、 西維因西維因 Carbaryl Carbaryl 、

17、多菌靈及克菌丹多菌靈及克菌丹 Captan Captan 等。等。農(nóng)藥的檢測：農(nóng)藥的檢測： ELISA ELISA檢測檢測 “非典型肺炎冠狀病毒非典型肺炎冠狀病毒 ELISA ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的運(yùn)用在結(jié)締組織病早期診斷中的運(yùn)用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2A2hnRNPA2hnRNPA2/ /類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎PtAPtA3333抗體抗體ELISAELISA在疾病診斷中的作用在疾病診斷中的作用 ELISA ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體法檢測幽門螺桿菌抗體ELISAELISA試劑盒商業(yè)資訊試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒試劑盒酶聯(lián)免疫井酶聯(lián)免疫井DNM-9602GDNM-96