TA連接感受態(tài)細(xì)胞制備轉(zhuǎn)化及篩選

1、實(shí)驗(yàn)一、PCR產(chǎn)物與T載體的連接T vector 1 l10ligation buffer 1 lPCR回收產(chǎn)物回收產(chǎn)物 7 lT4 DNA Ligase 1 l輕彈管底混合，離心機(jī)甩一下，置25oC水浴12h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置-20oC保存?zhèn)溆?。（低溫連接效果比室溫好）。1. 連接反應(yīng)連接反應(yīng)2. TA克隆原理克隆原理 TagDNA 聚合酶的一個(gè)功能：聚合酶的一個(gè)功能： 使使PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端突出一個(gè)端突出一個(gè)A。3 AA 3553 TT 355 商業(yè)設(shè)計(jì)的商業(yè)設(shè)計(jì)的T載體：在載體：在3端多出一個(gè)端多出一個(gè)T。 兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。應(yīng)

2、用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮T可能已經(jīng)丟失。其他說明：其他說明：1 1） 連接反應(yīng)的連接反應(yīng)的關(guān)鍵關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體比例為片段與載體比例為2:1 2:1 或或3:13:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。定比例。2 2）平端連接）平端連接 平端連接通常需要先將載體的平端連接通常需要先將載體的5 5 端磷酸去掉，然后再進(jìn)端磷酸去掉，然后再進(jìn)行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。 當(dāng)載體的當(dāng)載體的5 5 端磷酸去掉后，片段與載體

3、的連接就會(huì)留下端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會(huì)留下一個(gè)缺口，連接酶由于載體一個(gè)缺口，連接酶由于載體5 5 端缺乏磷酸而無法形成磷酸二端缺乏磷酸而無法形成磷酸二酯鍵，酯鍵， 轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會(huì)將缺乏的磷酸基團(tuán)加上，再形成磷酸二酯鍵。再形成磷酸二酯鍵。 實(shí)驗(yàn)二、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌在低滲培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌在低滲 CaClCaCl2 2 存存在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。 另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對(duì)外源另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對(duì)外源DNAD

4、NA的攝的攝取能力增強(qiáng)。取能力增強(qiáng)。1. 感受態(tài)細(xì)胞制備原理2.2.注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 1）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。 如果反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜如果反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)胞狀態(tài)，失去接受外源胞狀態(tài)，失去接受外源DNADNA的能力。的能力。2 2）無菌操作。）無菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。 各種器具均需消毒各種器具均需消毒。無菌操作的注意事項(xiàng) 槍頭、EP管、試管、平皿

5、等，各種試劑都是經(jīng)過高壓滅菌后在超凈臺(tái)中專用的，但加樣器需要自帶。取飯盒中的槍頭、EP管時(shí)，都要用在酒精燈上燒灼后的鑷子夾取。燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要在酒精燈上燒灼一下瓶口。塑料制品，如槍頭和EP管不能用酒精燈燒灼。手臂盡量不要在敞開的容器上方移動(dòng)，以免落入雜菌。超凈臺(tái)事先要打開紫外燈照射至少20 min進(jìn)行消毒，使用時(shí)要打開風(fēng)機(jī)，。操作前要用酒精擦拭手臂或帶手套。無菌超凈工作臺(tái)無菌超凈工作臺(tái)1 1） 將大腸桿菌在將大腸桿菌在LBLB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，瓊脂培養(yǎng)基上劃線，3737o oC C12-12-1616小時(shí)。小時(shí)。2 2） 次日從瓊脂平板上取一單菌落于次日從瓊脂平

6、板上取一單菌落于2 2ml LBml LB培養(yǎng)培養(yǎng)基中，基中，3737o oC C，225rpm225rpm速度震蕩培養(yǎng)速度震蕩培養(yǎng)12-1612-16小時(shí)。小時(shí)。3 3） 取取1 1mlml上述培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)物接種于100100ml LBml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737o oC C， 225rpm 225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至的速度震蕩培養(yǎng)直至ODOD值為值為0.50.5左右左右( (約約3 3小時(shí)小時(shí)) )。 （上述（上述1 13 3步驟已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室完成）步驟已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室完成）水浴搖床水浴搖床 3. 感受態(tài)細(xì)胞的制備過程5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul 冰冷的 1

7、00mmol/L CaCl2 致敏液懸浮細(xì)胞，冰浴5分鐘。6）6000rpm，離心5分鐘，回收細(xì)胞，棄上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，懸浮細(xì)胞。7）4oC可保存1-2周；長(zhǎng)期保存， 可加甘油至終濃 度為15%，置-70oC備用。注意：（無菌操作）4） 取取1ml 菌液冰浴菌液冰浴5min，然后然后6000rpm，離心離心5 min ，收集菌體。，收集菌體。1 1）將）將200200 l l感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化置冰上融化，然后加入，然后加入3 3 l l DMSODMSO, , 混合后，加入混合后，加入1010 l l連接反應(yīng)液連接反應(yīng)液( (含重組質(zhì)粒

8、含重組質(zhì)粒), ), 溫和混勻，置冰上溫和混勻，置冰上1010分鐘分鐘。 ( (目的：防止細(xì)胞被脹破。目的：防止細(xì)胞被脹破。) ) 2）42oC，45秒，秒，然后然后迅速放回冰中迅速放回冰中1-2分鐘。分鐘。1. 轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)步驟3）加入1 ml LB培養(yǎng)液， 37oC，225rpm搖蕩培養(yǎng)30min。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 4） 6,000rpm，離心離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約秒鐘，倒掉上清，用剩余的約 200 l LB培養(yǎng)液重懸菌體。培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，將殘存菌液輕輕混勻， 鋪于含有氨基芐青霉素的鋪于含有氨基芐青霉素的 LB瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫

9、放置5-10min，倒置于，倒置于37孵箱中培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)14-16小時(shí)。小時(shí)。注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)化后的平皿面朝下放置： 防止水蒸氣形成的水滴影響細(xì)菌單菌落的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后整理實(shí)驗(yàn)臺(tái), 值日生值日!2. TA克隆原理克隆原理 TagDNA 聚合酶的一個(gè)功能：聚合酶的一個(gè)功能： 使使PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端突出一個(gè)端突出一個(gè)A。3 AA 3553 TT 355 商業(yè)設(shè)計(jì)的商業(yè)設(shè)計(jì)的T載體：在載體：在3端多出一個(gè)端多出一個(gè)T。 兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。兩者的粘性末端可以互補(bǔ)配對(duì)。應(yīng)用時(shí)避免反復(fù)凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮T可能已經(jīng)丟失。無菌操作的注意事項(xiàng) 槍頭、EP管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過高壓滅菌后在超凈臺(tái)中專用的，但加樣器需要自帶。取飯盒中的槍頭、EP管時(shí)，都要用在酒精燈上燒灼后的鑷子夾取。燒