抗體的純化與檢測詳細(xì)版

1、 抗體的純化和檢測抗體的純化抗體的檢測 怎么純化我們想要的抗體？常見單抗的結(jié)構(gòu)、種類、性質(zhì)每個單抗等電點(diǎn)、電荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性質(zhì)各不相同。選擇單抗的純化方法，既要了解他們的共性，又要了解個性，從而制定相應(yīng)的純化策略(下表 3)。單抗特性及純化策略單抗特性及純化策略純化步驟# #抗體的純化抗體的純化# #抗體 純化的步驟# #抗體的純化抗體的純化# #飽和硫酸銨沉淀法 飽和硫酸氨分級沉淀法是從溶液中分離蛋白質(zhì)的常用方法。這是一種比較原始，非特異性分離技術(shù)。 飽和硫酸氨沉淀法作為抗體純化的第一步,難以得到高純度的抗體。但是它能夠濃縮和出去大部分的蛋白質(zhì)，尤其是脂蛋白# #抗體的純化

2、抗體的純化# #鹽離子溶液水分子蛋白質(zhì)溶液競爭關(guān)系溶解度基本原理這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而被廣泛應(yīng)用。水化膜強(qiáng)強(qiáng)弱弱2， 操作步驟 以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸 銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% 50% （一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ） 根據(jù)樣品中的蛋白質(zhì)的含量以及種類的配制飽和濃度的硫酸銨溶液來沉淀樣品中的大多數(shù)蛋白質(zhì)。當(dāng)然這一步也有利于后邊的層析。出去雜質(zhì)破碎沉淀細(xì)胞抗體在里邊鹽析蛋白充分沉淀蛋白樣品預(yù)處理10000r，30min

3、離心保留上清液加入飽和SAS（1:1）攪拌過夜（4度）透析袋沉淀離心沉淀蛋白沉淀10000r，30min，離心溶解PBS溶液疊氮鈉棄上清液蛋白成分：抗體，極少量雜蛋白，SAS3-6個小時更換一次透析緩沖液（24-48h） 親和層析是一種快速有效的生物活性物質(zhì)的純化方法,它通過偶聯(lián)蛋白對目的蛋白選擇性的吸收和分離吸收和分離,可取得較高的純化效果,且操作簡便,廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗室抗體純化。由于產(chǎn)品價格昂貴,使用成本較高,限制了它的運(yùn)用。Protein A/GProtein A/G親和層析親和層析 Protein A A 蛋白是金黃色葡萄球菌的表面蛋白,分子量為42 KD ,有6 個不同的IgG結(jié)合位

4、點(diǎn)。其中有5 個位點(diǎn)對IgG的Fc 片段顯示很強(qiáng)的特異性親和力,不同的位點(diǎn)獨(dú)立地與抗體結(jié)合。但I(xiàn)gA , IgM , IgE 也可能結(jié)合在配體上,當(dāng)達(dá)到飽和時,一個A 蛋白分子至少可以結(jié)合兩個IgG分子。A 蛋白對IgG有高親和力和特異性,這一特點(diǎn)使之非常適合用于純化腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清中的單克隆抗體 Protein G G蛋白是一種源自鏈球菌G族的細(xì)胞表面蛋白，一種三型Fc受體。其通過類似于A蛋白的非免疫機(jī)制與抗體的Fc段結(jié)合。像A蛋白一樣，G蛋白與IgG 的Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是，Protein G Sepharose 還可以特異性低親和地與重鏈的CH1及輕鏈的C 結(jié)合而用于純化Fa

5、b 及F(ab)2。另外，ProteinG可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合許多類型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同時血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配體脫落也相對更低。重鏈重鏈Protein A-Sep harose CL2-4B 親和層析柱分離提純IgG Protein A-Sepharose CL24B 親和層析法的原理: A 蛋白可與IgG上的Fc 段特異性地結(jié)合,與小鼠IgG的各亞類表現(xiàn)為不同的結(jié)合力,結(jié)合的強(qiáng)弱程度依次是: IgG2a IgG2b IgG3 IgG1 。A 蛋白的這種結(jié)合也是具有p H 依賴性的,即可利用改變p H 及離子強(qiáng)度,純化與其結(jié)合較弱的IgG1。洗脫腹水處理裝柱平衡

6、上樣12000r，15min，去除大的凝塊將Protein A-Sep harose CL-4B 干粉溶解,再用p H 7. 4 的磷酸鹽緩沖液 浸泡15min ,然后裝入層析柱中。緩沖液平衡柱子，測ph=7.4緩沖液稀釋，濾膜過濾用ph=4.0的檸檬酸溶液洗脫抗體，再用ph=9.0的Tris-hcl緩沖液調(diào)節(jié)至7.0。應(yīng)用A KTA explorer100 進(jìn)行監(jiān)測,當(dāng)觀察到基線開始上升,即出現(xiàn)洗脫峰時,開始收集洗脫液至洗脫峰回到基線后，使用上樣緩沖液平衡柱子平衡電泳鑒定采用SDS 不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳層析圖及電泳結(jié)果AKTAAKTA蛋白純化系統(tǒng)蛋白純化系統(tǒng)AKTA主要是根據(jù)電導(dǎo)率的不同級

7、鹽濃度的不同來洗脫不同的物質(zhì)。系統(tǒng)主要分為兩部分，分別是檢測系統(tǒng)和層析柱，根據(jù)洗脫的不同的ph值來確定洗脫的物質(zhì)是什么。當(dāng)然全自動的AKTA系統(tǒng)可以多柱，多樣品，多緩沖液，多組份檢測，其檢測功能包括多波長紫外/可見光、電導(dǎo)、pH、壓力、溫度、等等。功能很強(qiáng)大。MabSelect 系列大規(guī)模抗體純化親和層析介質(zhì) MabSelect 是一系列最新的大規(guī)模純化抗體的親和層析介質(zhì)。它們的特點(diǎn)包括： 更高的流速和動態(tài)載量 更低的宿主雜蛋白吸附，抗體純度更高 更低的蛋白A脫落 更易于工藝的線性放大 MabSelect易于清洗與除菌，壽命更長、更經(jīng)濟(jì) 生產(chǎn)過程無動物血清成分CaptoAdhere原理：Cap

8、to Adhere介質(zhì)專為治療用抗體的分離純化而設(shè)計，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）綜合了陰離子交換、氫鍵和疏水等多種復(fù)雜的作用方式，因此對于抗體的聚集體具有非常獨(dú)特而高效的去除能力；此外，通過有效的實(shí)驗設(shè)計 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere介質(zhì)還可以同時有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、內(nèi)毒素和潛在的病毒。Capto Adhere是一種流穿模式流穿模式的純化系統(tǒng)，能夠?qū)⑺拗鞯鞍?、脫落的蛋白A和聚集體降低到很低的水平，載量可達(dá)100-200mg/ml介質(zhì)，單步收率90%。此外，Capto Adhere還具有很強(qiáng)的病毒去除的能力。將Mabselect SuRe和Capto Adhere相結(jié)合進(jìn)行兩步層析純化。Mabselect SuRe可以達(dá)到99%的抗體純度，親和洗脫峰使用Captoadhere的流穿模式進(jìn)行精純: 使抗體分子流穿而聚集體、宿主蛋白、脫落的蛋白A配基等雜質(zhì)結(jié)合在Adhere柱上加以去除。這樣僅用兩步層析就可以得到符合藥用級質(zhì)量要求的高純度抗體產(chǎn)品，大大縮短了工藝時間，提高生產(chǎn)效率，同時增加了