人單核細(xì)胞趨化蛋白-1MCP-1ELISA試劑盒使用說明書

1、人單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1 ELISA試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定人血清,血漿及相關(guān)液體樣本中人單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)的含量實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)水平.用純化的人單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中 依次參加單核細(xì)胞趨化蛋白 -1 (MCP-1)再與HRP標(biāo)記的單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)抗 體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物, 經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色.TMB在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終

2、的黃色.顏色的深淺和樣品中的單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1 )呈正相關(guān).用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測(cè)定吸光度(OD值),通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)濃度.試劑盒組成試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1X481X 962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品：360ng/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標(biāo)試劑3 ml X 1 瓶6 ml x 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml x 1 瓶6 ml x 1

3、 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 ml x 1 瓶6 ml x 1 瓶2-8 C保存顯色劑B液3 ml x 1 瓶6 ml x 1 瓶2-8 C保存終止液3ml x 1 瓶6ml x 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml x 30 倍)x 1 瓶2-8 C保存樣本處理及要求：1 .血清：室溫血液自然凝固 10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上 清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心.2 .血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清

4、,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次 離,°3 .尿液：用無菌管收集,離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分).仔細(xì)收集上清,保存過程 中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心.胸腹水、腦脊液參照實(shí)行.4 .細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無菌管收集.離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/ 分).仔細(xì)收集上清.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用 PBS (PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞 濃度到達(dá)100萬/ml左右.通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份.離心 20分 鐘左右2000-3000車t/分.仔細(xì)收集上清.保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心.5 .組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,稱取重量

5、.參加一定量的PBS, PH7.4.用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?標(biāo)本融化后仍然保持2-8C的溫度.參加一定量的PBS PH7.4,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分.離心 20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/分.仔細(xì)收集上清.分裝后一份待 檢測(cè),其余冷凍備用.6 .標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn).假設(shè)不能馬上 進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于 -20 C保存,但應(yīng)防止反復(fù)凍融 .7 .不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的HRP活性. 操作步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100出然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品

6、稀釋液50 4,混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 d分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50小混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50M棄掉,再各取50 M分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 M分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50出混勻后從第七、第八孔中分別取 50 M加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋液50 口,混勻后從第九第十孔中各取50 M棄掉.稀釋后各孔加樣量都為50小濃度分別為 240ng/L, 160ng/L , 80ng/L, 40ng/

7、L , 20ng/L.2 .加樣：分別設(shè)空白孔空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同、待測(cè)樣品孔.在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40小 然后再加待測(cè)樣品10 口樣品最終稀釋度為5倍.加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混 勻.3 .溫育:用封板膜封板后置 37 c溫育30分鐘.4 .配液：將30 48T的20倍倍濃縮洗滌液用蒸儲(chǔ)水30 48T的20倍倍稀釋后備用.5 .洗滌：小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干.6 .加酶：每孔參加酶標(biāo)試劑 50 4,空白孔除外.7 .溫育:操作同3.8 .洗滌：操作同5.9 .

8、 顯色：每孔先參加顯色劑 A50U,再參加顯色劑 B50M,輕輕震蕩混勻,37c避光顯色 15分鐘.10 .終止：每孔加終止液 50聞終止反響此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色.11 .測(cè)定：以空白空調(diào)零,450nm波長依序測(cè)量各孔的吸光度 OD值.測(cè)定應(yīng)在加終止 液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行.考前須知：1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘前方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存.2 .濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果.3 .各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以防止試驗(yàn)誤差.一次加樣時(shí)間最控 制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣

9、.4 .請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最做復(fù)孔.如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高樣本 OD值大 于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD值,請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)n倍后再測(cè)定,計(jì)算 時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)XnX5o5 .封板膜只限一次性使用,以防止交叉污染.6 .底物請(qǐng)避光保存.7 .嚴(yán)格根據(jù)說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) 8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理.9 .本試劑不同批號(hào)組分不得混用.10 .如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn). 計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值仃4"才日自 COrlEifetEticU (X.T代入