PRRSV經(jīng)典株與Nsp2變異株RT-PCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、PRRSV經(jīng)典株與Nsp2變異株RT-PCR鑒別診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（檢驗(yàn)SOP）1 適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）經(jīng)典毒株與Nsp2基因缺失株的特異性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）區(qū)分技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于疑似感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的豬的組織、血液及其他病料樣品。2 . 試劑2.1 天根公司 TIANamp Virus RNA Kit 病毒 RNA 提取試劑盒，目錄號(hào)：DP315-R2.2 賽百盛公司 goldview2.3 天根公司 Quant One Step RT-PCR Kit 目錄號(hào)：KR1132.4 瓊脂糖2.5 分析純酒精（99.7%）

2、2.6 6 DNA 電泳 Loading Buffer3 實(shí)驗(yàn)室條件3.1 儀器：PCR儀、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、電泳儀、電泳梢、冰箱、紫外儀、微量移液器、水浴箱等。3.2 從事PCR工作的實(shí)驗(yàn)室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出DNA提取區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。特別注意電泳后的瓊脂糖凝膠要及時(shí)處理，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成污染。4 . 試劑的準(zhǔn)備4.1 擴(kuò)增 PRRSV 的引物： PRRSV P1、 PRRSV P2、 PRRSV LOW。4.2 1.5%瓊脂糖凝膠加入0.1% goldview4.3 1 TAE緩沖液4.4 goldview4.5 滅菌超純水4.6 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)( Marker DL1

3、000)5 . 操作步驟5.1 樣品處理處理材料：a.材料為發(fā)病豬只血液、血清或淋巴液可直接吸取140b.材料為細(xì)胞上清液，可直接使用140區(qū)新鮮上清混勻。c. 材料為貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融三次，然后3000r/min離心5min,取上清液140區(qū)bd.材料為病豬肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病料樣品時(shí)，需要先用生理 鹽水或PBS進(jìn)行研磨，收集研磨物后反復(fù)凍融3次，12 000r/min離心10min, 取上清140wLo5.2 用移液器將560L Carrier RNAT作液(為裂解液RL與Carrier RNA溶 液的混合液，配制方法如附錄配液表配制)加入一個(gè)干凈的1.5mL離

4、心管 中。注意：如果樣本體積大于 1401,可等比例增加工作溶液和無(wú)水乙醇的用量。5.3 向離心管中加入140區(qū)檢測(cè)樣品（樣品需平衡至室溫），渦旋振蕩 15秒混勻。注意：為了保證裂解充分，樣品和Carrier RNA 工作液需要徹底混勻。5.4 在室溫（15-25）孵育10分鐘。5.5 簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。5.6 加入560區(qū)疣水乙醇，蓋上管蓋并渦旋振蕩15秒。注意：如果周圍環(huán)境高于25 , 乙醇需要在冰上預(yù)冷后再加入。5.7 簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。5.8 仔細(xì)將離心管中的630W腋體轉(zhuǎn)移至RNase-fre破WttiCR2（吸附柱放 在2mL收集管中），蓋上

5、管蓋，6000g （8000rpm）離心1分鐘，棄廢液, 將吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液體未能全部離心至收集管中，請(qǐng)加大轉(zhuǎn)速，延長(zhǎng)離心時(shí)間至液體完全轉(zhuǎn)移到收集管中，如為組織苗，在過(guò)柱前請(qǐng)離心后將上清液過(guò)柱。5.9 重復(fù)此步驟7。5.10 小心打開吸附柱蓋子，加入500小蟒液GD （使用前請(qǐng)先檢查是否已 加入無(wú)水乙醇），蓋上管蓋，6000g （8000rpm）離心1分鐘，棄廢液， 將吸附柱放回收集管。5.11 小心打開吸附柱蓋子，加入500區(qū)喀液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已 加入無(wú)水乙醇），蓋上管蓋，6000g （8000rpm）離心1分鐘，棄廢液， 將吸附柱放回收集管。5.12 將

6、吸附柱放回收集管中，13,400 g （12,000rpm）離心3分鐘，使吸 附膜完全變干，棄廢液。注意：乙醇的殘留可能會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。5.13 可選步驟：將吸附柱放回2mL收集管中，打開吸附柱蓋子，室溫放 置3分鐘，使吸附膜完全變干。5.14 將吸附柱放入一個(gè)RNase-free超凈離心管(1.5mL)中，小心打開 吸附柱的蓋子，向膜中央加入60區(qū)L RNase-free ddO,蓋上蓋子，室溫 放置5分鐘。6000g (8000rpm)離心1分鐘。5.15 可選步驟：將 上一步驟的洗脫 液再次 加入膜中 央，并6000為 (8000rpm)離心1分鐘，以增強(qiáng)RNA洗脫效果。注意： 確

7、保洗脫液( RNase-free ddH2O ) 在室溫平衡后再使用。 如果加入洗脫液的體積很小(小于50科1),為了將膜上的RNA充分洗脫下來(lái)，應(yīng)注意將洗脫液加到膜的中央位置。洗脫體積可以根據(jù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求靈活處理， 洗脫液 ( RNase-free ddH2O ) 加到吸附柱后， 離心前在室溫放置5分鐘，有助于提高RNA 的產(chǎn)量。5.16 將提取的RNA樣品按照下條件進(jìn)行RT-PCR,剩余部分請(qǐng)及時(shí)放入-80保存(所有配置工作均在冰上進(jìn)行) 。檢測(cè)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。配置如下體系：(25林L體系)Rnase-free ddHO8.75L10XRT-PCR buffer2.5dNTP Mixtu

8、re1.05 XRT-PCR enhancer5.0Hotmaster Taq polymerase1.25LQuant Rtase0.25LRnase0.25L擴(kuò)增引物(P1P2LOW)各1.0MRNA模板3.0區(qū)LPRRSV檢測(cè)反應(yīng)條件:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min50 cPCR預(yù)變性4min94 c變性40s94 c 退火40s55 c 3 35 Cycles延伸40s65 c,(6)延伸10min65 c保溫16C5.17 電泳5.17.1 制備1.5%瓊脂糖凝膠板。5.17.2 取5山PCR產(chǎn)物與1人的上樣緩沖液(10Moading buffer)混勻后加 入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。5.17

9、.3 加入分子量標(biāo)準(zhǔn)。5.17.4 蓋好電泳儀，插好電極，90V電壓電泳，1h。5.17.5 在紫外儀觀測(cè)下用數(shù)碼相機(jī)照相并進(jìn)行照片存檔。5.17.6 用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。6 .結(jié)果判定每次樣品應(yīng)當(dāng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照(經(jīng)典毒株與Nsp2缺失毒株)及空白對(duì)照，若待檢樣品擴(kuò)增出與經(jīng)典毒株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相同的特異性 條帶且空白對(duì)照無(wú)條帶，即可判為經(jīng)典毒株感染；若檢測(cè)樣品擴(kuò)增出Nsp2 基因缺失株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相同的特異性條帶且空白對(duì)照無(wú)條帶，即 可判斷為Nsp2基因缺失毒株感染；未擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小相近的特異性條帶，則判為陰性；若空白對(duì)照擴(kuò)增出與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照相似的條帶，則該次

10、實(shí)驗(yàn)判為失敗，應(yīng)當(dāng)重新進(jìn)行一次RT-PCR檢測(cè)圖1 PRRSV的檢測(cè)結(jié)果M: Marker DL1000 ; +1為CH-1a株陽(yáng)性對(duì)照，+2為經(jīng)典株陽(yáng)性對(duì)照、+3為變異株陽(yáng)性對(duì)照；1、2、3、4為樣品編號(hào)。注：藍(lán)耳變異株擴(kuò)增目的片段為180bp，藍(lán)耳經(jīng)典株擴(kuò)增目的片段為250bp。附錄：TAE電泳緩沖液（50 X）1 0.5mol/L乙二俊四乙酸二鈉（EDTA）溶液二水乙二俊四乙酸二鈉滅菌雙蒸水氫氧化鈉滅菌雙蒸水2 TAE電泳緩沖液（50 X配制 三羥甲基氨基甲烷（Tris）冰乙酸0.5mol/L乙二俊四乙酸二鈉溶液滅菌雙蒸水3 1%瓊脂糖凝膠的配制 瓊脂糖TAE電泳緩沖液（1 X）(pH8.0)18.61g80mL調(diào)pH至8.0力口至100mL242g57.1mL(pH8.0)100mL力口至 1 000mL1.5g100mL微波爐中完全融化，加goldview5也混勻。樣品個(gè)數(shù)RV（mL） Carrier RNA水溶液（卜）樣品個(gè)數(shù)RV（mL） Carrier RNA水溶液0.565.6137.2872.84 . Carrier R