中草藥多糖分離提取和理化性質(zhì)研究報告

1、個人資料整理 僅限學習使用No ri fleast :rmCfUfi tverst t y題目：中草藥多糖的分離提取和理化性質(zhì)研究姓名：*學院：生命科學學院年級：2018級學號:20180*個人資料整理 僅限學習使用中草藥的分離提取和理化性質(zhì)研究生命科學學院2018級*201801*摘要：本實驗采用熱水浸提和乙醇醇沉的方法提取刺五加多糖，得到的粗多糖回收率為1.21%，再對得到的粗多糖進行定性、定量分析。用苯酚一硫酸法測定已提取出的粗多糖中單寡糖與多糖的含量為14.7% ;經(jīng)過薄層層析分析單糖的組成，其中組成多糖的單糖多屬于葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖；用Sepharsose CL 6B 柱層析法

2、測定多糖的相對分子量約為 3.47 萬道爾頓。高效液相色譜分析單糖含的結(jié)果是刺五加多糖中的單糖種類有半乳 糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，其中含量較多的葡萄糖和甘露糖。關鍵詞：刺五加多糖分離提取理化性質(zhì)多糖是由單糖連接而成的多聚物，人們對多糖的研究已經(jīng)有很長時間的歷 史，對多糖的初始研究可追溯到1936年Shear對多糖抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)，至20世紀50年代，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些真菌多糖和高等植物多糖具有明顯的抑瘤活性。最 近又發(fā)現(xiàn)許多中藥多糖還具有降血糖作用。70年代以來，科學家們發(fā)現(xiàn)多糖及糖復合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構成材料，重要的是它存在于一切 細胞膜結(jié)構中，參與生命現(xiàn)象中細胞的各種活動

3、。多糖類物質(zhì)是所有生命有機 體的重要組成部分，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞壁中，是生物體內(nèi)除 核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子?？茖W研究已經(jīng)確認糖類物質(zhì)具有 許多生物活性，包括抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且對機體幾乎無毒 副作用。中藥多糖因具有增強機體免疫功能及抗腫瘤降血糖等藥理作用，而且 幾乎沒有毒性與副作用，因此引起國內(nèi)外藥理學家、生物學家和化學家們的關 注。多糖的提取應根據(jù)多糖的來源和提取部位的不同確定所用提取方法。多糖 的提取方法主要有水提法、酸提法、堿提法、超聲提取法和微波提取法等。本 次實驗的材料為刺五加，采用水提法提取刺五加多糖，利用苯酚一硫酸比色法 間對多糖含量

4、進行測定，并依次利用薄層層析法、高效液相色譜法以及分子篩 層析對刺五加多糖的理化性質(zhì)進行分析。1材料與方法1.1實驗材料個人資料整理 僅限學習使用刺五加1.2實驗試劑濃硫酸、葡萄糖、6%苯酚、標準樣木糖、半乳糖醛酸、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖）、三氟乙酸TFA）、展開劑正丁醇：乙 酸：水=4：1：5）、顯色劑苯胺一鄰苯二甲酸正丁醇飽和水溶液）、1-苯基- 3-甲基-5-吡唑啉酮PMP）、氫氧化鈉NaOH）、濃鹽酸HCI）、磷酸二氫鈉NaH2PO4 2H2O）、磷酸氫二鈉Na2HPO4 12H2O）、無水乙醇VCH3CH2OH）、無水甲醇CH3OH）、氯仿CH3CI）、超純水、藍

5、色葡聚 糖，重鉻酸鉀及相對分子量為15.3萬，46.1萬的葡聚糖標準品、生理鹽水等。1.3實驗儀器可見分光光度計、分析天平、離心機、SHIMADZU LC-10ATV島津）液相色譜儀、SHIMADZU LC島津）色譜柱、層析缸、硅膠板10X10 cm）、毛 細管、噴霧器、烘箱、水解小瓶、蒸發(fā)皿、吹風機、層析柱1.5 cmX00 cm、 恒流泵、自動部分收集器、紫外檢測儀、記錄儀、可見光分光光度計、容量瓶、移液槍、試管等。1.4實驗方法1.4.1多糖的分離、提取與純化稱取曬干的刺五加約30g,用蒸餾水浸泡約24h后，在80C下煮提1.5h, 用紗布過濾取濾液至鐵鋼中，再加入少量水按以上方法分別煮

6、提1h、0.5h,將3次得到的濾液在120C下濃縮至50ml以下，轉(zhuǎn)移至兩成為250ml燒杯中，加 入3倍體積95%乙醇中，封上封口膜保存。醇沉后倒出上清，將沉淀3000r/min離心15min，取出沉淀，沉淀依次用無水乙醇、乙醚脫水，P2O5真空干燥過夜，即得粗多糖。1.4.2多糖含量測定準確稱取無水葡萄糖10 mg，加少量蒸餾水溶解，后定容至于100 mL，得 葡萄糖標準液。分別準確量取標準液00號管）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于大試管中，補加蒸餾水至1.0 mL。向每只試管中加入6%苯酚0.5 mL，混 勻，再加入濃硫酸2.5 mL，立即振蕩，室溫放置10 min，以

7、0號管為參比，于490 nm測定光吸收值。以葡萄糖的微克數(shù)為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制 標準曲線。個人資料整理 僅限學習使用準確稱取多糖樣品10 mg,先用少量蒸餾水溶解，然后定容至100 mL，得到多糖溶液。1號管中加入1.0 mL蒸餾水，2、3、4號管中加入1.0 mL多糖溶 液。分別向每個試管中加入6%苯酚溶液0.5 mL,振蕩混勻， 濃硫酸2.5 mL，立即振蕩。 冷卻10 min后，以1號管作為參比，于490 nm測定2-4號管的光吸 收值。所得三個數(shù)值取平均值，根據(jù)標準曲線計算樣品中的多糖含量。1.4.3糖組成分析準確稱取干燥的糖樣5.0 mg，加入1.0 mL蒸餾水，充分溶解

8、后轉(zhuǎn)移至水解 小瓶中，再加入1.0 mL 4 M TFA，120C水解5 h。將水解液平均轉(zhuǎn)入2個蒸發(fā) 皿中其中一份用于薄層層析法測定單糖組成，另一份份用于高效液相色譜法測 定單糖組成），向蒸發(fā)皿中加入適量無水乙醇，在水浴上蒸干，除去三氟乙 酸。用于薄層層析法測定單糖組成的一份水解樣品，蒸干三氟乙酸后，加入1mL甲醇溶解蒸發(fā)皿底部的樣品，用移液槍將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL的塑料離心管中，待用。將硅膠板水平放置，在距薄板一端2 cm處用鉛筆畫一直線，在直線上，以1.0 cm間隔打點作為點樣位置。并在每個點下方標明標樣或樣品名稱。 分別點上標樣及待測樣品水解后的多糖），待測樣品點樣量為10uL層析缸

9、內(nèi)加入展層劑，液面高度約為0.5 cm。將硅膠板在此密閉裝置中展層。觀察溶 劑跑至距硅膠板頂端約1 cm時，從層析缸中取出硅膠板，記錄溶劑前沿。將硅 膠板用吹風機吹干，然后用噴霧器向板上噴灑顯色劑苯胺一鄰苯二甲酸正丁醇飽和水溶液），100 C烘箱中放置15 min，即顯現(xiàn)各斑點。測量每個斑點中心 距離加樣原點的距離，計算相對遷移率Rf值）。通過與標準品單糖的Rf值比 較，初步判斷樣品中含有的單糖種類。用于高效液相色譜法測定單糖的一份水解樣品，蒸干后加入0.5 mL 0.3 M的PMP試劑和0.5 mL 0.3 M的NaOH溶液，充分混勻。取0.1 mL樣品置于1.5 mL塑料離心管中，70C水

10、浴30 min。每組做5管。待冷卻后，取其中3個 管，分別加入0.3 M鹽酸溶液0.05 mL和超純水0.05 mL，充分混勻，將這3個 離心管中的液體合并于其中一個離心管。加入0.7 mL三氯甲烷進行萃取，混勻后離心，棄去有機相下層），保留水層。重復萃取過程2次。合并水層。水層經(jīng)0.22ym濾器過濾后，用HPLC進行單糖組成分析。島津LC-10ATvp泵， 島津SPD-10Avp紫外檢測器，島津色譜柱，流動相為PBSvO.1 M，pH 7.0）:個人資料整理 僅限學習使用乙腈=82.2:17.8W/V），流速為1.0 ml/min，自動進樣，檢測波長為245 nm。 與標準糖樣的各保留時間相

11、比較，確定刺五加多糖可檢測出Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Ara;由于摩爾含量和峰面積成正比，故根據(jù)檢測出的各種 單糖的峰面積，可以計算得到刺五加多糖中各種單糖的摩爾含量比。1.4.4相對分子量分布將10 mg樣品標準糖樣混合物為每種各取2 mg左右，待測樣品）溶于1 ml緩沖液中，離心除去不溶物質(zhì)。用SepharoseCL-6B柱層析法測定樣品的相對分子量分布。SepharoseCL-6B層析柱的條件：層析柱流速為0.2 ml/min，收 集器調(diào)為15mi n/管收集。洗脫柱中依次加入藍色葡聚糖、重鉻酸鉀及相對分子 量為15.3萬的葡聚糖標準品混合物，相對分子量分別為7萬和

12、46.1萬的葡聚糖標準品混合物，實驗制備的多糖樣品。洗脫完畢，用苯酚-硫酸法測多糖的相對分子量分布。2結(jié)果與分析2.1粗多糖回收率測定稱取刺五加原樣為30.3g,得到粗多糖樣品為0.3662g。所以，此次回收率為1.21%。2.2多糖含量測定個人資料整理 僅限學習使用葡萄糖標準曲線圖一葡萄糖標準曲線待測樣品123平均值吸光值0.2500.2570.2800.2535表一 待測樣品吸光值結(jié)果由標準曲線公式y(tǒng)=1.2526+0.0690可以求得待測樣品的濃度為0.0147mg/mL。所以，提取出的粗多糖中單寡糖與多糖的含量為14.7%2.3薄層層析測量每個斑點中心距離加樣原點的距離，計算相對遷移率

13、Pk #Retention TimeAreaHeight2Man19.220549765203083Rha26.715726090201814GalUA32.510876788194885Glc39.60356838599766Gal45.5121852460304217Xyl47.2661515474242098Ara50.273147770022244表三混合標樣的高效液相色譜分析結(jié)果個人資料整理 僅限學習使用3Minutes圖四待測樣品的高效液相色譜圖譜Detector A (245nmPk #Retention TimeAreaHeight11PMP12.459816788982808

14、19012Man17.2419595213775914Rha24.3176191521325615GalUA28.870270192556416Glc34.9971836304136922017Gal40.06838252797093418Xyl41.868506664933819Ara44.407124126221191表四待測樣品的高效液相色譜分析結(jié)果與標準糖樣中各保留時間相比較，確定刺五加多糖中可檢測出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7種單糖。由于摩爾含量和峰面積成正比，故根據(jù)檢測出的各種單糖的峰面積，可以計算得到其摩爾含 量比為Man：Rha：GalUA:Gl

15、c：Gal:Xyl:Ara=4:2：1:71:15:2：5。2.4 Sepharose CL-6B層析柱測定相對分子量分布柱高：96.0cm柱體體積=(1.5/2)2XnX96169.56cm3利用苯酚一硫酸法測定樣品峰值，得到以下數(shù)據(jù):test 1-6Pk #II10152025303540455055個人資料整理 僅限學習使用管數(shù)體積洗脫體積藍葡聚糖19 管57cm3重鉻酸鉀53 管159cm315.3 萬葡聚糖38 管114cm357cm346.1 萬葡聚糖28 管384cm327cm待測樣品51 管153cm3398cm表五由公式Kav=VeVo)/VtVo)可得，15.3萬葡聚糖的K

16、av=0.5146.1萬葡聚糖的Kav=0.24圖五標準曲線待測樣品的Kav=0.87所以，由標準曲線得知，待測樣品的相對分子量為3.47萬，即刺五加多糖的Mr為3.47萬。3討論本組通過水提法得到的刺五加粗多糖的回收率為1.21%,較其他組的回收率高，分析原因有兩個，一是在浸提過程中我們組采用80攝氏度左右的火力加熱，浸提時間也較長，使得刺五加中的成分更多地溶于水中，從而獲得較多的 粗多糖；另外，在浸提過程中，過濾后的濾液中還是有很多不溶物，導致所得 的樣品較多。在多糖含量測定中，利用苯酚 一硫酸法提取出的粗多糖中單寡糖與多糖的 含量為14.7%。我們的三個待測樣品中，有一個樣品的數(shù)據(jù)較另外

17、兩個值較 大，說明有較大偏差，因此平均值只用兩個值求得。利用薄層層析法分析單糖組成，初步判斷樣品含有的單糖種類有葡萄糖、 阿拉伯糖和甘露糖三個人資料整理 僅限學習使用種單糖。而高效液相色譜法分析單糖組成，與標準糖樣中 各保留時間相比較，可檢測出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳 糖、木糖和阿拉伯糖7種單糖。由于摩爾含量和峰面積成正比，故根據(jù)檢測出 的各種單糖的峰面積，可以計算得到其摩爾含量比為Man：Rha：GalUA:Glc：Gal：Xyl:Ara=4:2：1：71：15：2：5。可知，葡萄糖的含量最多，甘 露糖的含量次之，其余五種單糖的含量較少。兩種方法相比較，高效液相色譜 法更加靈敏、準確，但是薄層層析法的操作相對簡單。Sepharose CL-6B層析柱測定相對分子量分布測定多糖的相對分子量約為3.47萬道爾頓。在做標準曲線時，我們組只測出15.7萬道爾頓和46.1萬道爾頓大小的葡聚糖的峰，缺少7萬道爾頓大小的葡聚糖的峰。分析原因是可能7萬的葡聚糖最后跑出來的含量太少，導致在利用苯酚一硫酸法測定該峰時，樣液濃度較低，從而沒有測出峰所在位置；也有可能是我們組在測定峰值時操作存 在問題導致沒有測出7萬葡聚糖的峰的所在管數(shù)。另外，其他組的待測樣品最 終測出兩個峰，即有兩種多糖。我們組只有一