北京大學醫(yī)學部攻讀碩-博士學位研究生課題研究計劃書

1、北京大學醫(yī)學部攻讀士學位研究生課題研究方案書研究生 李玉霞學號1411210743年 級 2021級院部北京大學/香港科技大學醫(yī)學中央專業(yè)醫(yī)學生物化學與分子生物學導師方征宇課題研究開始日期：2021年03月 09日北京大學研究生院醫(yī)學局部院培養(yǎng)辦公室制表本方案書由研究生本人在本學科內作過開題報告后填 寫,一式三份；經院部主管部門批準后一份留教研室, 一份留院部主管部門,一份送研究生院醫(yī)學局部院 培養(yǎng)辦公室備案.方案批準后不得隨意更改.如有特殊情況確需變更者, 需填寫變更報告,逐級審批.研究課題名稱黑色素瘤順鉗獲得性耐藥相關microRNA篩選及其功能的研究研究課題的目的、理論與實際意義、國內外

2、研究情況簡介課題的目的：1、構建黑色素瘤順鉗獲得性耐藥細胞株,與其原始株進行microRNA的高通量篩選比擬,找到耐藥相關的microRNA,作為潛在的治療靶點.2、分析耐藥相關microRNA通過調控哪些基因的表達來影響黑色素瘤細胞的耐藥性,說明其分子機制.理論與實際意義：近幾十年來,惡性黑色素瘤在全球的發(fā)病率迅猛升高,成為所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤,年增長率幾乎到達 3-5%.其中白色人種發(fā)病率明顯高于其他人種,我國和日本等亞洲國家的黑色素瘤發(fā)病率與歐美國家相比相對較低,但近年來其發(fā)病率呈迅猛上升趨勢.惡性黑色素瘤治療方法主要有手術治療、放射治療、化學藥物治療及生物免疫治療等.化療

3、在惡性黑色素瘤治療中仍占有重要地位.目前化療藥物主要有順鉗、長春新堿和組蛋 白去乙?；敢种苿┑?順鉗是現(xiàn)在臨床上多種化療方案中的主要藥物之一,通過與癌細胞的脫氧核糖核酸發(fā)生交叉聯(lián)結,誘導腫瘤細胞的凋亡而起抗癌作用屬細胞增殖周期非特異性藥物,但是多種惡性黑色素瘤常會對順鉗產生天然或獲得性耐藥,因而提升順鉗的抗腫瘤作用,解決順鉗耐藥在惡性黑色素瘤的化療中有著重要的實際意義.順鉗耐藥機制,主要包括細胞內藥物積累的減少,DNA損傷修復作用增強,凋亡通路的變化以及一些microRNA的異常表達.由于microRNA的表達易于調控,如果能找到黑色素瘤中與耐藥相關的microRNA,可建立以此為靶點的干預

4、手段.國內外研究情況簡介：在其他腫瘤細胞中,已經有人驗證出一些microRNA的變化會影響腫瘤對順鉗的敏感性,而目前關于 microRNA在黑色素瘤順鉗獲得性耐藥機制中的作用研究較少.主要研究內容研究內容1:構建黑色素瘤順鉗耐藥株選取了七種黑色素瘤細胞系 M7、M21、SK-MEL-103 M29、A375、M8、SK-MEL-19依 次檢測對順鉗的敏感性,在對順鉗比擬耐受的細胞株中選取了 A375、M8、SK-MEL-19構建了順 鉗耐藥株并將 A375、M8做了 microRNA的表達譜芯片.研究內容2：黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株microRNA芯片分析及驗證通過分析 microRNA表達

5、譜芯片,對黑色素瘤順鉗耐藥株中異常表達的microRNA用熒光定量PCR®行驗證,確定要研究的microRNA.研究內容3:順鉗耐藥相關基因反向篩選預測microRNA查閱文獻,匯總順鉗耐藥相關基因,在黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株中用熒光定量PCR驗證,根據耐藥基因的變化反向預測microRNA.研究內容4： microRNA對黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機制根據microRNA靶基因預測數據庫找到靶基因,進一步研究microRNA對順鉗黑色素瘤耐藥的影響及其分子機制.主要研究方法1、構建黑色素瘤順鉗耐藥株MTS法檢測藥物敏感性以及順鉗耐藥株的耐藥指數.2、黑色素瘤順鉗耐藥株與原始株

6、microRNA芯片分析及驗證Real-time PCR驗證 microRNA 芯片結果.3、順鉗耐藥相關基因反向篩選預測microRNAReal-time PCR驗證順鉗耐藥相關基因,microRNA靶基因預測數據庫分析結果.4、microRNA對黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機制Dual-Luciferase Reporter驗證microRNA與靶基因的關系,慢病毒構建靶基因相關穩(wěn)轉株, Western Blotting驗證靶基因相關蛋白的變化.研究進度及具體安排2021年3月-2021年8月進度：黑色素瘤順鉗耐藥株構建2021年9月-2021年12月進度：microRNA芯片分析及驗證

7、,順鉗耐藥相關基因的篩選2021年1月-2021年10月安排：microRNA對黑色素瘤順鉗耐藥的影響及其分子機制的研究預期結果1、通過microRNA芯片找到與黑色素瘤順鉗耐藥相關的microRNA2、通過microRNA靶基因預測數據庫找到microRNA的靶基因3、microRNA的靶基因通過調節(jié)細胞內的相關蛋白對順鉗耐藥有作用,通過敲除或者過表達該基因可以逆轉黑色素瘤順箱獲得性耐藥.協(xié)助導師具體指導的人員配備周游博士后、細胞培養(yǎng)技術員黎滿慧、試劑采購技術員董小林完 成 課 題 的 條 件主要儀器設備情況Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad Rael-time PCR儀、Bio-Rad 酶標儀、Bio-Rad 蛋白電泳儀、 Eppendorf離心機、Stuart渦旋振蕩器、Wise Therm干浴鍋、超凈臺、顯微鏡、-20C 冰箱等實驗動物情況沒有動物實驗藥物試劑等來源情況DMEM(GIBCO)、 PBS(Invitrogen) 、 Tyrisin(GIBCO)、 MTS(Promega)、 Lipofection2000(Promega) 、 RT kit(Promega)、 Real-time supe