血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳ppt課件

1、血清蛋白質(zhì)聚丙血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤烯酰胺凝膠圓盤電泳電泳第六組 蛋白質(zhì)的分別v蛋白質(zhì)是生物大分子化合物，具有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點蛋白質(zhì)分別純化的方法主要有：鹽析、透析、超離心、電泳、離子交換層析、分子篩層析等方法。透析透析超速離心超速離心凝膠過濾層析凝膠過濾層析離子交換層析離子交換層析電泳技術(shù)的原理電泳技術(shù)的原理v電泳蛋白質(zhì)在一定的pH溶液中可帶有電荷，成為帶電顆粒，在電場中向相反的電極方向泳動。由于蛋白質(zhì)的分子量和電荷量不同，其在電場中的泳動速率也不同，從而將蛋白質(zhì)分別成泳動速率快慢不等的條帶。v電荷的來源v 蛋白質(zhì)帶有可解離的氨基-NH2和羧基(-COOH),是典型的兩

2、性電解質(zhì)，在一定PH條件下會解離帶上電荷COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH蛋白質(zhì)陰離子蛋白質(zhì)陰離子甘氨酸陰離子甘氨酸陰離子垂直板電泳的優(yōu)點：垂直板電泳的優(yōu)點：v外表積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更明晰。v可多個樣品的電泳v膠板制造方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高。v膠版薄而透明，可制成干板，便于長期保管與掃描。v可進展雙向電泳。血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳中，只可以分別出56條區(qū)帶，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中可分別出數(shù)十條區(qū)帶。v實驗器材與試劑v器材v圓盤電泳槽、電泳儀、脫色

3、搖床、染缸、微量加樣器、注射器、小燒杯v試劑緩沖液PH值準確配置后用PH計調(diào)試試劑編號試劑名稱配置14*分離膠緩沖液1mol/L鹽酸24.0mL/100mL, Tris 18.2g/100mL (pH 8.9)230%單體交聯(lián)劑丙烯酰胺30.0g與甲叉雙丙烯酰胺0.8g 100mL3催化劑10%過硫酸銨 （臨用前配置）4加速劑TEMED 1mL加蒸餾水到10mL54*濃縮膠緩沖劑mol/L 鹽酸48mL/100mL, Tris 5.98g/100mL (pH6.7)610*電極緩沖劑甘氨酸28.8g與Tris 6.0g 加蒸餾水至100mL 稀釋(pH 8.3)臨用前十倍稀釋72*上樣緩沖劑溴

4、酚藍0.05g 20mL甘油，加5號試劑25mL，定溶至100mL8固定液三氯乙酸12.50g 加蒸餾水至100mL9考馬斯亮藍R250染色液1.25g考馬斯亮藍R250,溶于227mL甲醇中加蒸餾水227mL冰醋酸46mL10脫色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合v實驗操作v凝膠柱的預(yù)備凝膠溶液配制表見教材表4-4取 玻 璃 管 ，一 段 封 口參與分別膠溶液(7cm)參與蒸餾水制備分別膠應(yīng)迅速為了使外表平整，與空氣隔絕靜 置 待 凝 膠聚合濃縮膠制備(1cm)汲取上外表蒸餾水待凝膠與水面的界面重新可辨切勿觸動膠面參見分別膠參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速參與分別膠溶液(7cm)

5、制備分別膠應(yīng)迅速參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速參與蒸餾水為了使外表平整，與空氣隔絕取 玻 璃 管 ，一 段 封 口參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口參與蒸餾水為了使外表平整，與空氣隔絕參與分別膠溶液(7cm)制備分別膠應(yīng)迅速取 玻 璃 管 ，一 段 封 口v裝柱v 將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，參與電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)v加樣v 取血清

6、12L ，7號試劑12L混勻，品均參與4管，每管6L.加樣槍不可插入過深，以免刺破凝膠，同時要緩慢、均勻，以免攪動緩沖液引起樣品分散。v電泳v 接通電源，上負下正，先調(diào)理電流1mA/管，待示蹤染料進入分別膠后調(diào)理為23 mA/管，待示蹤染料離管下口0.5cm時切斷電源。v剝膠v 注入蒸餾水做光滑劑，針頭螺旋式前進，漸漸剝離。v固定、染色及漂洗v 將凝膠柱浸入8號劑中泡10min，進展固定，用9號劑染色10min，用清水沖洗，放入10號劑中漂洗脫色。v結(jié)果表示圖 2 1本卷須知：v丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，留意防止直接接觸留意防止直接接觸v丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，用前檢測丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，用前檢測pH值值能否失效。失效液不能聚合。能否失效。失效液不能聚合。v加速劑加速劑TEMED要密封保管，過硫酸溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，防止氧化要密封保管，過硫酸溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，防止氧化失效。失效。v配好膠后應(yīng)盡快灌膠不要構(gòu)成氣泡配好膠后應(yīng)盡快灌膠不要構(gòu)成氣泡v切記裝柱后運用蒸餾水密封切記裝柱后運用蒸餾水密封v灌膠和電泳時要留意排