四環(huán)素族抗生素定向發(fā)酵

1、吉林化工學院生物工程專業(yè)實驗報告實驗題目：四環(huán)素族抗生素定向發(fā)酵Tetracycline antibiotics directional fermentation課程類型： 生物工程專業(yè)實驗 實驗類型： 設計型專業(yè)班級： 學生姓名： 學生學號：合作者： 指導教師： 提交日期： 2015年11月23日吉 林 化 工 學 院Jilin Institute of Chemical Technology四環(huán)素族抗生素定向發(fā)酵實驗 摘要：通過金色鏈絲菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，了解定向發(fā)酵的意義。另外通過實驗更進一步學會根據(jù)抗生素生物合成的不同途徑尋找各種抑制劑或促進劑，以調(diào)節(jié)某些酶的活性,從而改變

2、代謝途徑。四環(huán)素和金霉素都能在酸性條件下加熱生成黃色脫水四環(huán)素和脫水金霉素其產(chǎn)生黃色的深淺與它們的含量多少成正比。所以通過反應比色即可知道二者地總含量（預先要做好四環(huán)素濃度的標準曲線），稱其為總效價。關鍵詞：金色鏈絲菌、定向發(fā)酵、四環(huán)素族抗生素、金霉素、總效價前言：定向發(fā)酵是指通過改變培養(yǎng)基的組分(如加入某些物質(zhì))改變微生物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的某種產(chǎn)物。金色鏈絲菌能同時產(chǎn)生四環(huán)素和金霉素，這二種抗生素在分子結構上只是在第七位上差一個氯離子。四環(huán)素族抗生素族抗生素包括金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學結構極為相似：當R1為Cl,R2為H時分子為金霉素；當R1和R2都為H時為四環(huán)素

3、；當R1為H，R2為OH時為土霉素（羥基四環(huán)素）。金霉素比四環(huán)素只多一個氯離子，只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。從生物合成途徑上可知四環(huán)素和金霉素有一段相同的生物合成途徑，到某一個中間產(chǎn)物時，氯化酶活力的大小可能決定其合成途徑的改變，所以我們設計從控制氯化酶的活性和氯化酶的量來影響菌種的代謝途徑，從而得到不同的產(chǎn)物。本實驗是通過在改變培養(yǎng)基的組分，來實現(xiàn)定向發(fā)酵。我們從下面兩個方面考慮:（1）抑制氯化酶的活力利用硫醇基苯駢噻唑（M-促進劑）與氯化酶的激活劑二價銅離子作用，降低銅離子的濃度，從而使氯化酶的活力下降。（2）利用競爭性抑制劑來減少氯化

4、酶的量加入一種基質(zhì)，其能與某一反應的酶作用，使此反應的酶量減少，從而使此反應受到抑制的現(xiàn)象一般稱競爭抑制。本實驗利用溴離子在生物合成中對氯離子有競爭性抑制作用的原理。據(jù)研究四環(huán)素與金霉素有一共同的代謝分叉的間體，此中間體進一步的代謝方向取決于不同酶活力的大小，其示意圖見（圖31）圖31四環(huán)素和金霉素分叉代謝示意圖圖31中A為四環(huán)素和金霉素的代謝分叉中間體，在此之前，四環(huán)素和金霉素的代謝途徑相同，A物質(zhì)在E1酶的作用下生成B物質(zhì)，它進一步代謝即生成四環(huán)素（TC）。A物質(zhì)在有氯離子存在時，在氯化酶E2的作用下生成ACl，然后再在E1酶的作用下生成BCl，再進一步反應即生成金霉素(CTC)。因此，A

5、物質(zhì)究竟向那個方向代謝，則取決于系統(tǒng)中氯離子與氯化酶存在的多少，所以若把氯化酶的量減少，反應就會較多的向四環(huán)素方向進行?，F(xiàn)考慮加入溴化物作為競爭性抑制劑，因為氯化酶E2也可以催化溴化物的形成，從而消耗掉一些氯化酶減少金霉素的形成，在反應中也形成了一些溴四環(huán)素，但此反應速度較慢，整個反應還是形成較多四環(huán)素。此反應中隨溴離子量的增加四環(huán)素量也有所增加，但隨氯離子的增加四環(huán)素的量會減少。上述兩個作用都有一定的局限性，第一個措施受硫醇苯駢噻唑毒性的影響，第二個措施受溴四環(huán)素的量和氯離子的限制，所以在生成四環(huán)素的過程中若用金色鏈絲菌用作生成菌、在水中又存在氯離子時，常將兩個措施一起用，以最大限度地減少金

6、霉素地量。2、化學法測定四環(huán)素和金霉素地原理如下：實驗利用比色法測定四環(huán)素和金霉素的效價。四環(huán)素和金霉素都能在酸性條件下加熱生成黃色脫水四環(huán)素和脫水金霉素其產(chǎn)生黃色的深淺與它們的含量多少成正比。所以通過反應比色即可知道二者地總含量（預先要做好四環(huán)素濃度的標準曲線），稱其為總效價。在堿性條件下，金霉素不穩(wěn)定，可生成無色的異金霉素，而四環(huán)素則比較穩(wěn)定，然后將其在酸性條件下產(chǎn)生的黃色，比色測出的即為四環(huán)素的量。將測出的總效價值減去四環(huán)素的效價值即為金霉素的效價。 金霉素 異金霉素發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)

7、素脫水條件(降低酸度或延長加熱時間)可以減少雜質(zhì)對比色反應的干擾。本實驗用一支金色鏈絲菌在加入氯離子、硫醇基苯駢噻唑和溴化鈉等物質(zhì)的作用下看四環(huán)素和金霉素的產(chǎn)生量的多少，來驗證上述原理和措施。通過培養(yǎng)基的配制和接種、發(fā)酵最后通過化學手段測定四環(huán)素和金霉素的效價，本實驗因為培養(yǎng)時間較長學生實驗可分二次進行。1實驗內(nèi)容：配制種子培養(yǎng)基和四種發(fā)酵培養(yǎng)基、接種子、轉(zhuǎn)發(fā)酵。放瓶；測效價；利用比色法測定四環(huán)素和金霉素的效價。2實驗材料和儀器：1、金色鏈絲菌菌種（由實驗室提供）。旋轉(zhuǎn)式搖床：轉(zhuǎn)速230轉(zhuǎn)/分。2、培養(yǎng)基原材料；（1）種子培養(yǎng)基配方：花生餅粉 2 (20g/L)；淀粉4 (40g/L)；酵母粉

8、0.5 ；蛋白胨0.5 ；硫酸胺0.3 ；硫酸鎂0.025 %；磷酸二氫鉀0.025 %；碳酸鈣0.4 %；PH自然。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基配方：花生餅粉4 (40g/L)；淀粉10 ；酵母粉0.2 ；蛋白胨1.4；硫酸胺0.25 ；硫酸鎂0.25 %；淀粉酶0.02 %；碳酸鈣0.5 %；pH自然。EDTA 試劑，取乙二胺四乙酸二鈉鹽 4.5 克，和NaOH 5.5克溶解于5000ml 蒸餾水中。固體草酸、乙二胺四醋酸二鈉鹽（EDTA）混合試劑、4 N鹽酸、721分光光度計3實驗步驟：（1）配種子培養(yǎng)基，配制時淀粉要先糊化。配置100ml , 取30 ml，250ml 三角瓶中八層紗布，外加牛皮紙

9、。（2）接種：種子培養(yǎng)基消毒后冷卻，在無菌室中將金色鏈絲菌斜面挖一小塊放入培養(yǎng)基中然后放在旋轉(zhuǎn)式搖床上28培養(yǎng)20小時。（3）配發(fā)酵培養(yǎng)基：先將所需淀粉糊化后冷卻至60左右，加入淀粉酶。在60水浴中保溫1020分鐘待淀粉液化后在把其它成分放入。（4）將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基分成四分分別編號：配置200ml , 分別取4次，每次40 ml，放置250ml 三角瓶中八層紗布，外加牛皮紙。1對照（即為上述培養(yǎng)基）2加入0.3溴化鈉3加入0.3%氯化鉀4加入0.3%溴化鈉和0.0015%M-促進劑（M促進劑的原始濃度為0.05%）（5）接發(fā)酵:種子長好后（不染菌、種子液較粘稠、菌絲粗壯）接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種

10、量為10 。再放入搖床轉(zhuǎn)速220-230r/min，28 培養(yǎng)5天。4標準曲線繪制標準溶液配制，精確稱取四環(huán)素標準品，若干毫克溶于50 ml 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，配制成四環(huán)素標準溶液，使溶液濃度為1000 U/ml 左右標準曲線繪制， 分別吸取上述標準溶液，1.0 ml, 0.8 ml.0.6 ml,0.4 ml,0.2 ml于50ml容量瓶中， 加EDTA 混合試劑11 ml ,放置5 min 后，再加2.0 mol/L HCL 4 ml 與此同時，另外做5只空白樣品，操作方法相同，然后將空白樣品直接用蒸餾水稀釋至刻度，而樣品放在沸水中加熱5 min ,冷卻后，測定的吸光度A440

11、為縱坐標，作標準曲線。1、放瓶：搖瓶從搖床上拿下來后應進行下列參數(shù)的測試與觀察：pH、 顏色、粘度、氣味及慮速等實驗數(shù)據(jù)。2、 固體草酸調(diào)pH至1.5-2.0，調(diào)試過程中要充分搖勻，避免過酸。3、 濾得濾液。4、 四環(huán)素效價得測定：取濾液0.3-0.5ml（視效價高低而定）放入50ml容量瓶中加入EDTA混合試劑（含NaOH）11ml放置5分鐘加2mol/L鹽酸4ml煮沸5分鐘迅速冷卻后，用蒸餾水稀釋至刻度用分光光度計上440nm波長下比色，測得光密度值A440后查標準曲線即可得四環(huán)素的效價。四個樣品均按上法測試，每個樣品均需單獨做對照對照做法同上只是取消加熱直接稀釋，比色時一一對應。終止發(fā)酵

12、過程記錄終止發(fā)酵時間，搖床轉(zhuǎn)速，搖床溫度。記錄發(fā)酵液的粘度（掛瓶程度）；顏色；氣味；;pH 值；鏡檢菌絲體（留照片）。固體草酸調(diào)pH至1.5-2.0，調(diào)試過程中要充分搖勻，避免過酸。用250ml塑料離心杯，每杯裝入兩個平行發(fā)酵瓶中的發(fā)酵液。用5000轉(zhuǎn)/分離心-5分鐘，取其上清液。四環(huán)素效價測定四環(huán)素的吸光度= 總吸光度- 對照（底色）吸光度。對照（底色）吸光度分析樣品制備法使用移液管取離心上清液2ml放入50 ml容量瓶中加入EDTA混合試劑（含NaOH）11ml搖勻后放置5分鐘加2mol/L鹽酸4ml，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用酶標儀測定底色吸光度?？偽舛确治鰳悠返闹苽浞ㄊ褂靡埔?/p>

13、管取離心上清液2ml放入50 ml容量瓶中加入EDTA混合試劑（含NaOH）11ml搖勻后放置5分鐘加2mol/L鹽酸4ml，搖勻（別激動現(xiàn)在不定容）煮沸5分鐘迅速冷卻后，再用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，。酶標儀測定總吸光度。四個樣品均按上法測試，每個樣品均需單獨做對照，對照樣做法同上只是取消加熱直接稀釋。比色時其位置要一一對應，以便于計算?？傂r的測定總效價吸光度 = 總吸光度- 對照（底色）吸光度?？傂r總吸光度分析樣品的制備法：取發(fā)酵液離心上清液2ml加入50ml容量瓶中加入蒸餾水11ml，搖勻。加入2mol/L鹽酸4ml，搖勻。 煮沸5分鐘迅速冷卻后稀釋至50ml，搖勻。酶標儀測總效價。方

14、法同上只是不加熱直接稀釋。（2）總效價對照（底色）吸光度分析樣品制備法：取發(fā)酵液離心上清液2ml加入50ml容量瓶中加入蒸餾水11ml，搖勻。加入2mol/L鹽酸4ml，搖勻。 直接用蒸餾水稀釋至50ml，搖勻。酶標儀測總效價。5總效價的測定取濾液0.3-0.5ml加入50ml容量瓶中加入蒸餾水11ml加入2mol/L鹽酸4ml煮沸5分鐘迅速冷卻后稀釋至50ml用440nm波長下比色，所得光密度查標準曲線即得各樣品的總效價，各樣品也要做對照。方法同上只是不加熱直接稀釋。6結果發(fā)酵時間=5天 搖床轉(zhuǎn)速=210r/min 搖床溫度=28數(shù)據(jù) 第一組第二組（溴化鈉）第三組（氯化鉀）第四組（促進劑）發(fā)

15、酵液粘度適中適中適中較粘稠有明顯掛壁現(xiàn)象顏色黃色黃色黃褐色褐色氣味無明顯刺激性氣味無明顯刺激性氣味稍微有點酸氣無明顯刺激性氣味效價數(shù)據(jù)記錄總效價吸光度 = 總吸光度- 對照（底色）吸光度。四環(huán)素的吸光度= 總吸光度- 對照（底色）吸光度。數(shù)據(jù) OD第一組第二組（溴化鈉）第三組（氯化鉀）第四組（促進劑）四環(huán)素效價（對照）0.1260.0740.0820.117四環(huán)素效價0.1760.1320.1170.217總效價(對照）0.1760.0760.1280.083總效價0.2350.1430.2080.204結果計算組別OD第一組第二組（溴化鈉）第三組（氯化鉀）第四組（促進劑）四環(huán)素效價0.050

16、0.0580.0350.1總效價0.0590.0670.080.121分別將四環(huán)素效價和總效價的OD值帶入四環(huán)素效價標準曲線y=3.8756x里面可得OD效價第一組第二組（溴化鈉）第三組（氯化鉀）第四組（促進劑）四環(huán)素效價0.193780.2248370.13567750.38765總效價0.228710.259730.310120.4691數(shù)據(jù)效價第一組第二組（溴化鈉）第三組（氯化鉀）第四組（促進劑）金霉素效價0.034930.0348930.174440.08145四環(huán)素是兩性化合物，等電點是5.4，而蛋白質(zhì)的等電點也在5.3左右。如果將PH調(diào)至5.4，蛋白質(zhì)也會沉降，起不到分離目的。而四

17、環(huán)素類抗生素在4.0-7.0（這兩個數(shù)字不是很準確，待確定）之內(nèi)均能沉淀，故調(diào)至4.5-4.6。另外四環(huán)素類抗生素在PH>5.0時，不是很穩(wěn)定，所以調(diào)PH時用比較弱的堿氨水。實驗中，因為操作原因?qū)е聦嶒炗姓`差，其中三號試驗品略微有染菌的跡象發(fā)生。但總體來說還在可控的實驗誤差范圍之內(nèi)根據(jù)圖表結果可以看出加入0.3%溴化鈉和0.0015%M-促進劑的實驗組在四環(huán)素方面有明顯的提升，有助于菌種對四環(huán)素的分泌和生產(chǎn)，而其他兩組并沒有明顯的提升。試驗后我們經(jīng)網(wǎng)上查詢發(fā)現(xiàn)金色鏈霉菌經(jīng)溶菌酶處理形成的原生質(zhì)體細胞，可增大對紫外線的敏感性。選育出的菌株H32-37是一株形態(tài)上變異較大的高產(chǎn)菌株，四環(huán)素生

18、產(chǎn)效價可穩(wěn)定在26000r/ml，較出發(fā)菌株提高了44.4%。其發(fā)酵性能較好且遺傳性穩(wěn)定，具有一定的生產(chǎn)應用前景。據(jù)結果表格可知加入0.3溴化鈉和0.3%氯化鉀和0.3%溴化鈉和0.0015%M-促進劑均對四環(huán)素的效價有明顯提升，其中加入0.3%溴化鈉和0.0015%M-促進劑的提升最高。另外加入0.3%氯化鉀對于金霉素的效價提升最高鳴謝我歷時將近一周時間終于把這篇論文寫完了，在這段充滿奮斗的歷程中，帶給我的學生生涯無限的激情和收獲。在論文的寫作過程中遇到了無數(shù)的困難和障礙，都在同學和老師的幫助下度過了。在此，我向指導和幫助過我的老師們表示最衷心的感謝！同時，我也要感謝本論文所引用的各位學者的專著，如果沒有這些學者的研究成果的啟發(fā)和幫助，將無法完成本篇論文的最終寫作。至此，我也要感謝我的朋友和同學，他們在我寫論文的過程中給予我了很多有用的素材，也在論文的排版和撰寫過程中提供熱情的幫助！金無足赤，人無完人。由于我的學術水平有限，所寫論文難免有不足之處，懇請各位老師和同學批評和指正！參考文獻1，丁煥新. 四環(huán)素在非感染疾病中的臨床應用. 新醫(yī)學，1989；20(3)：1522，劉加升. 四環(huán)素在外科疾病中的硬化治療近況. 新藥與臨床，1991；10(5)：2853，F(xiàn)ord L M, Eaton T E, Godfrey O W. Selection of St