《環(huán)境微生物的檢測與分析》實驗指導20150113

1、 環(huán)境微生物的檢測與分析實驗指導編者：吳方麗 李歐 浙江理工大學生命科學學院二零一四年十二月中國 浙江 杭州目 錄實驗一 土壤微生物拮抗菌的分離與測數(shù)5實驗二 拮抗菌的鑒定與保藏16實驗三 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析技術(shù)及其在微生物種群多樣性研究中的應用31附錄 各種培養(yǎng)基、試劑的配制41實驗一 土壤微生物拮抗菌的分離與測數(shù)一、實驗目的1、熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準備工作及操作方法。2、初步掌握從土壤中分離微生物和測數(shù)的基本方法。3、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握其配制過程和方法。4、掌握實驗室?guī)追N滅菌方法及技術(shù)。5、掌握無菌操作技術(shù)。6、了解平板菌落計數(shù)的原理。7、識別土壤中幾大類微生

2、物的菌落特征。8、學習拮抗作用的試驗方法，觀察微生物間的拮抗現(xiàn)象及抗生素的抗菌作用。二、實驗原理自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類的微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離純化。在自然界中，土壤是微生物生活的良好環(huán)境，各種微生物混居生活在一起。其中生活的微生物的數(shù)量和種類極其豐富，因此土壤是人類開發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤中微生物的數(shù)量、種類與土壤肥力有關(guān)，肥沃的土壤中多，貧瘠的土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質(zhì)，如通氣性、pH有關(guān)。例如在通氣良好的

3、菜園土中，好氣性微生物占有絕對優(yōu)勢。本實驗以肥沃的菜園土為實驗材料分離土壤中的好氣性細菌、放線菌和霉菌，并進行數(shù)量測定。分離微生物常用的方法有：稀釋涂平板法、稀釋混合平板法、劃線分離法等。根據(jù)不同的實驗材料可以采用不同的分離方法。其最終目的是在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離的微生物的單個菌落，必要時再對單菌落進行進一步的分離純化。本實驗分離細菌時采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、分離放線菌時采用高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、分離霉菌時采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。稀釋平板計數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上一個活的單細胞繁殖能形成一個菌落這一培養(yǎng)特征設計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個活的單細胞。計數(shù)時，首先將待測樣品制成一系列稀

4、釋液，再取一定稀釋度，一定體積的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布到平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，根據(jù)稀釋倍數(shù)即可計算出樣品中的含菌數(shù)。由于此方法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。一般用于某些產(chǎn)品檢定，如根瘤菌劑等產(chǎn)品的檢定，生物制品檢驗，土壤中可培養(yǎng)微生物含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗等方面。拮抗作用是微生物之間普遍存在的一種相互關(guān)系。它是某些微生物生命活動中產(chǎn)生的一種特異性代謝產(chǎn)物抗生素，具有抑制或殺死另一些微生物的作用。能產(chǎn)生抗生素的微生物稱為抗生菌。平板對峙法常用于拮抗菌對離體植物病原菌的拮抗作用的測定。其原理是，把抗生

5、菌與供試病原菌同時置于同一培養(yǎng)基平板上，由于抗生菌對病原菌的拮抗作用，抗生菌菌落邊緣與病原菌菌落邊緣之間會產(chǎn)生一定的抑菌距離。抑菌距離越大，拮抗作用越強。組織法常用于拮抗菌對活體植物病原菌的拮抗作用的測定，也可用于化合物的活性測定。其原理是把抗生菌所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)預先接種于即將發(fā)病的植物組織上或接種在已發(fā)病的植物組織上，由于抗生菌所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對病原菌的拮抗作用，病原菌無法致病或延緩病原菌的致病作用。三、實驗材料1、器材：電子天平、帶有玻璃珠的三角瓶、搖床、1mL的無菌吸管、10mL的刻度試管、無菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH試紙、封口膜、記號筆、線繩、紗布、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌器、稱

6、量紙、藥匙、試管架、涂布棒、酒精燈、超凈工作臺、火柴。2、試劑和材料：無菌牛皮紙袋、無菌鏟、標簽、打孔器，鑷子，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸餾水、新鮮馬鈴薯、10%酚酞、乳酸。四、實驗步驟（一）培養(yǎng)基的配制（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普遍的細菌基礎培養(yǎng)基。 配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 水 1000 mL pH

7、 7.4-7.61、稱量藥品按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分別放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。 2、加熱溶解 在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入鍋中，在電磁爐上小火加熱，并用玻璃棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則需先調(diào)pH值后再溶解瓊脂，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補充所失水分。3、調(diào)pH 用pH試紙或酸堿度計檢測培養(yǎng)基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，邊加邊攪拌，并隨時檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用1 mol/l HCL進

8、行調(diào)節(jié)。 pH調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4、過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。 5、分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約至試管高度的 1/5；分裝入三角瓶內(nèi)的以不超過其容積的一半為宜，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。 6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要適合，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長3/5塞

9、入試管口或瓶口內(nèi)，以防止棉花脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。 7、包扎 加塞后，將三角瓶的棉花外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防止滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應先把裝同類培養(yǎng)基的試管扎成捆后，再于棉花塞外包一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。 8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于121攝氏度濕熱滅菌30 min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內(nèi)暫存。 9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜面的長度不超過試管總長的1/2；待其凝固， 10、無菌檢查 將滅菌的培

10、養(yǎng)基放入37攝氏度溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用?；騼Υ嬗诒浠蚯鍧嵉臋粌?nèi)，備用。 （2）、配制高氏一號培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。 配方如下： 可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 瓊脂20g 蒸餾水1000mL pH7.47.61、 稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加少許少量少于所需的水量，放入鍋中在電磁爐上邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。對微量成分FeSO4

11、83;7H2O可先配制成高濃度的儲備液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的儲備液，再在1000 ml的培養(yǎng)基中加入以上儲備液0.1 ml即可。待所有的藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如果要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。 2、pH 調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同上。（3）配制馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。 配方如下： 去皮的馬鈴薯 200g 蔗糖 20g 瓊脂20g 蒸餾水1000mL，自然pH 1、稱量和溶解 先計算后稱量，按用量稱取各成分。將去皮的馬鈴薯切

12、片后放入鍋中，然后加少許少于所需的水量在電磁爐上加熱20 min，然后用雙層砂布過濾，濾液重新放入鍋中煮沸，然后加入稱量好的蔗糖和瓊脂，待各成分溶解后，補充水分至所需體積。 2、同（2）2 （二）制備土壤稀釋液 （1）取土壤 取表層以下 510 cm 處的土壤樣品，放入滅菌的牛皮紙袋中，用鉛筆填寫好標簽，袋內(nèi)外各具一張。 （2）土壤預處理及保存將采集的樣品帶回實驗室平攤在聚乙烯塑料布上，在室溫下陰干，土塊捏碎，并檢出植物根、莖、葉及石塊等雜物，約20號篩篩分。土壤處理好后備用，或放在4攝氏度冰箱暫存。（3）制備土壤稀釋液（要無菌操作） 1、制備土壤懸液取土樣 5 g，迅速倒入帶玻璃珠的45 m

13、L無菌三角瓶中（玻璃珠用量以充滿瓶底為最好），置搖床中振蕩 510 min，使土樣充分打散，即成 10-1 的土壤懸液。2、稀釋用無菌移液管吸10-1 的土壤懸液0.5 mL，放入4.5 mL 無菌水中，震蕩混勻即為10-2 稀釋液，如此重復，可依次制成10-2 10-9 的稀釋液。注意：操作時移液管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支移液管，每次吸土液，要將移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。（三）混菌測定菌落數(shù)的方法 1、細菌 取10-7，10-8，10-9三管稀釋液各1ml，分別接入相應標號的平培養(yǎng)皿中，每個稀釋度接三個培養(yǎng)皿。然后取冷卻至50的牛肉膏

14、瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中（裝量以鋪滿培養(yǎng)皿底的2/3為宜），迅速輕輕搖動培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混均，但不沾濕培養(yǎng)皿的邊緣，待培養(yǎng)基凝固即成細菌平板，倒平板時注意無菌操作。2、放線菌取10-4，10-5，10-6 三管稀釋液，在每管中加入10%酚液56滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從三管吸出1ml加入相應標號的培養(yǎng)皿中，選用高氏1號培養(yǎng)基，用與細菌相同的方法倒入培養(yǎng)皿中，便可制成放線菌平板。 3、霉菌 取10-1，10-2，10-3三管稀釋液各1ml，分別接入相應的培養(yǎng)皿中，每個稀釋度接三個平皿。在溶好的馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基中，每100ml加入滅菌的乳酸1ml，輕輕搖勻，然后用與細菌相

15、同的方法倒入培養(yǎng)皿中，便可制成霉菌平板。 將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即培養(yǎng)皿蓋朝下放置，于 2830 攝氏度恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng) 12d，放線菌培養(yǎng) 57d，霉菌 35d。可用于觀察菌落，用于進一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。 （四）稀釋倒平板法測定菌落數(shù)的方法 1、倒平板將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基分別放入微波爐中熔化，將熔化好的培養(yǎng)基冷卻至50攝氏度至超凈工作臺中倒入滅菌好的培養(yǎng)皿中，待冷卻后編號備用。2、吸取土壤稀釋液用無菌吸管吸取取10-7，10-8，10-9三管土壤稀釋液各0.1 mL對號接種在不同稀釋度編號的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上。每個編號設3個重

16、復，用于分離細菌。用無菌吸管吸取取10-4，10-5，10-6兩管土壤稀釋液各0.1 mL對號接種在不同稀釋度編號的高氏一號培養(yǎng)基平板上。每個編號設3個重復，用于分離放線菌。用無菌吸管吸取取10-1，10-2，10-3 兩管土壤稀釋液各0.1 mL對號接種在不同稀釋度編號的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板上。每個編號設3個重復，用于分離霉菌。3、涂布平板用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)。注：無菌操作要點火焰消毒：在無菌環(huán)境

17、中進行培養(yǎng)或進行其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈。以后所有的操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都要在火焰附近操作并經(jīng)過灼燒進行。但要注意：金屬器械不能在火焰中灼燒時間過長，以防退火，燒過的金屬要待冷卻后才能夾取物品，以防造成物品損傷。吸過營養(yǎng)液的吸管不能再次進行灼燒，因殘留在吸管中的營養(yǎng)液能被燒焦成碳膜，再用時會把有害物帶入培養(yǎng)液中。開啟、關(guān)閉長有微生物的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防止溫度過高燒死細胞。另外，有橡膠塞的試管也不能灼燒時間太長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)的微生物。無菌操作：進行無菌操作前用75%的酒精擦拭超凈工作臺面及雙手。進行無菌操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，

18、以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已經(jīng)消毒的物品，如已接觸，要用火焰灼燒或取備用品更換。為了拿取方便，工作臺面上的東西要有合理的布局，原則上應將右手使用的東西放在右側(cè)，左手使用的東西放在左側(cè)，酒精燈放在中央。工作由始至終要保持一定的連續(xù)性，組織和細胞在未做處理前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；如果用過之后不再重復使用，應立即封閉瓶口直立。吸取各種液體時，均應分別使用吸管，吸管不能混用，以防擴大污染或?qū)е录毎徊嫖廴尽９ぷ髦胁荒芟虿僮髋_面講話或咳嗽，以免細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。（五）平板菌落計數(shù) 按下列標準從接種后的3個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度，求出

19、每克土壤中的含菌數(shù)。1、同一稀釋度各個重復的菌落數(shù)相差不太懸殊。2、細菌、放線菌以每培養(yǎng)皿30300個菌落為宜，霉菌一每培養(yǎng)皿10100個菌落為宜。3、選擇好計數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果按下式計算。混合平板計數(shù)法： 每g土壤樣品含菌數(shù)=同一稀釋度3次重復的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)稀釋倒平板計數(shù)法： 每g土壤樣品含菌數(shù)=同一稀釋度3次重復的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)注：未知菌判斷要點細菌菌落特征：細菌菌落大小不一，小的不到1 mm，大的可以鋪滿整個培養(yǎng)皿；菌落形狀有圓形、不規(guī)則形、卷發(fā)狀、假根狀等；菌落的隆起形狀有擴展、臺狀、低凸、乳頭狀等；有

20、點菌落有光澤，有的沒有；有的菌落較粘，有的較脆；菌落一般呈白色，少數(shù)為灰色、黃色、紅色、綠色和棕色等。放線菌菌落特征：放線菌的菌落質(zhì)地致密，表面呈緊密的絨狀、或堅實、干燥而多皺。由于基內(nèi)菌絲長在培養(yǎng)基內(nèi)，所以菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不容易被挑起，或被挑起后不容易被破碎。當孢子絲形成大量的孢子而不滿菌落表面時，使菌落呈絮狀、粉末狀或顆粒狀，而與細菌菌落判然有別。此外，如用放大鏡仔細觀察，可以看見菌落周圍有放射狀菌絲。霉菌菌落特征：霉菌菌落形態(tài)較大，外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)或松或緊的蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；菌落與培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑取，菌落正面與反面的顏色、構(gòu)造，以及邊緣與中心的顏色、構(gòu)造

21、常不一致等。由于霉菌的細胞呈絲狀，在固體培養(yǎng)基上生長時又有營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲的分化，而氣生菌絲間沒有毛細管水，故它們的菌落與細菌、酵母菌的不同，較接近放線菌。（六）拮抗菌的篩選平板對峙法1、真菌與細菌（1）NA培養(yǎng)基平板的制備：待NA培養(yǎng)基熔化后，冷卻至手摸不燙時，取10mL刻度試管，趁熱倒入培養(yǎng)基至10mL刻度，立即倒入9cm的培養(yǎng)皿中，制成厚薄均勻的培養(yǎng)基平板，備用。（2）細菌接種：在無菌條件下，從分離的平板中接種細菌培養(yǎng)過夜、備用。（3）真菌接種：用4mm打孔器從分離的平板上打制菌餅，然后將菌餅面朝下緊貼于PDA培養(yǎng)基接種到培養(yǎng)基平板一側(cè)，然后加蓋并標記（操作要迅速準確，菌餅放下后就不能

22、夠再移動）。于適宜溫度（一般為2528攝氏度）的培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。（4）結(jié)果檢查：培養(yǎng)57天后，取出PDA平板，用卡尺測量真菌菌落和細菌菌落邊緣之間的抑菌距離，單位為毫米（mm）。2、真菌與放線菌（1）高氏一號培養(yǎng)基平板的制備：待高氏一號培養(yǎng)基熔化后，冷卻至手摸不燙時，取10mL刻度試管，趁熱倒入培養(yǎng)基至10mL刻度，立即倒入9cm的培養(yǎng)皿中，制成厚薄均勻的培養(yǎng)基平板，備用。（2）放線菌接種：在無菌條件下，從分離的平板中接種放線菌培養(yǎng)23天，備用。（3）真菌接種：用4mm打孔器從分離的平板上打制菌餅，然后將菌餅面朝下緊貼于PDA培養(yǎng)基接種到培養(yǎng)基平板一側(cè)，然后加蓋并標記（操作要迅速準確

23、，菌餅放下后就不能夠再移動）。于適宜溫度（一般為2528攝氏度）的培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。（4）結(jié)果檢查：培養(yǎng)57天后，取出PDA平板，用卡尺測量真菌菌落和放線菌菌落邊緣之間的抑菌距離，單位為毫米（mm）。3、細菌與放線菌（1）細菌菌懸液的制備：對分離得到的細菌，接種到NA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，備用。（2）高氏一號培養(yǎng)基平板的制備：待高氏一號培養(yǎng)基熔化后，冷卻至手摸不燙時，取10mL刻度試管，趁熱倒入培養(yǎng)基至10mL刻度，立即倒入9cm的培養(yǎng)皿中，制成厚薄均勻的培養(yǎng)基平板，備用。（3）細菌接種：在無菌條件下，將制備好的細菌菌懸液涂布到高氏一號培養(yǎng)基平板，備用。（4）放線菌接種：在無菌條件下

24、，從分離的平板中接種放線菌與上述平板中央，然后加蓋并標記。于適宜溫度（一般為2528攝氏度）的培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。（4）結(jié)果檢查：培養(yǎng)23天后，取出平板，用卡尺測量細菌菌落和放線菌菌落邊緣之間的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm）。（七）拮抗菌的保藏短期保藏對具有拮抗作用的細菌、放線菌、真菌分別接種到NA培養(yǎng)基平板、高氏一號培養(yǎng)基平板、PDA培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)后存放于4冰箱保存（保藏期限13個月），備用。五、注意事項1、稱量藥品后應做好標記，勿與其它藥品混在一起，稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。2、注意pH值不要調(diào)過頭，以免影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。3、應用記號筆在相應的位置注明培養(yǎng)基的名稱、組別和日

25、期。4、放線菌的生長時間比較長，故制作平板時，培養(yǎng)基的量應多加一些。5、觀察菌落特點時應選擇分離的較開的很大的菌落，對培養(yǎng)基和試管要編好號碼，不要隨意移動開蓋，以免搞混菌號獲受到污染。6、實驗完成后，應即時對實驗數(shù)據(jù)進行收集、處理。7、在利用平板對峙法分析真菌與細菌、真菌與放線菌之間是否有拮抗作用時，接菌后菌絲塊勿移動。六、結(jié)果分析1、對菌落數(shù)進行觀察記錄，填入下表。并計算每克土壤中不同種類微生物的數(shù)量，并與理論值進行比較分析。培養(yǎng)基天濃度第一天第二天第三天第四天第五天第六天PDA培養(yǎng)基10-110-210-3高氏一號培養(yǎng)基10-410-510-6NA培養(yǎng)基10-710-810-92、平板對峙

26、法結(jié)果分析記錄實驗結(jié)果，分析真菌與細菌、真菌與放線菌之間是否有拮抗作用？七、思考題1、固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？2、培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？3、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有何不同？4、如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？5、平板培養(yǎng)時為什么要把培養(yǎng)皿倒置？6、在劃線分離時，為什么每次都需要將接種環(huán)上的剩余物燒掉？7、總結(jié)幾種接種技術(shù)的要點及注意事項。8、分離不同類群的微生物為何要選不同的稀釋度？9、稀釋平板分離測數(shù)法與血球計數(shù)板測數(shù)法各有何優(yōu)缺點？10、何為拮抗作用？舉例說明微生物與微生物之間的拮抗關(guān)系。實驗二 拮抗菌的鑒定與保藏一、實驗目的1、掌握微生物菌種鑒定的常

27、規(guī)方法。2、掌握微生物菌種的保藏方法。二、實驗原理微生物菌種鑒定對于更好的認識和利用微生物菌種具有重要的理論和實踐意義。目前常用的菌種鑒定方法包括形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、BIOLOG碳源自動分析鑒定、分子生物學鑒定、API細菌數(shù)值鑒定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄層層析、全細胞脂肪酸分析鑒定、（GC）mol測定、DNA/DNA同源性測定等。（1）常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和理化特性。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應、酶反應和血清學反應等。 （2）BIOLOG碳源自動分析鑒定 BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對不同碳

28、源的利用情況為基礎，檢測微生物的特征指紋圖譜，建立與微生物種類相對應的數(shù)據(jù)庫。通過軟件將待測微生物與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。 （3）分子生物學鑒定 應用分子生物學方法從遺傳進化角度闡明微生物種群之間的分類學關(guān)系，是目前微生物分類學研究普遍采用的鑒定方法。可采用核酸序列分析法分析細菌16S rDNA/16S-23S rDNA區(qū)間序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及絲狀真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列。（4）API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個鑒定系列，約有1000種生化反應，目前已可鑒定超過600種的細菌。鑒定過程中，可根據(jù)細菌

29、所屬類群選擇適當?shù)纳砩b定系列，通過軟件將待測細菌與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。 （5）功能性分析及功能基因 目前通過木聚糖酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、-甘露聚糖酶等功能基因的克隆進行菌種產(chǎn)酶的功能性分析。應用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌種鑒定，在某些種、亞種、株間有較好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技術(shù) 采用隨機擴增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技術(shù)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技術(shù)對微生物菌株進行鑒別。如采用RAPD技

30、術(shù)能夠?qū)ν痪N原始菌株與誘變菌株進行鑒別，對誘變菌株知識產(chǎn)權(quán)保護具有重要意義；采用SSCP技術(shù)進行工業(yè)酒精酵母菌株的鑒別，此技術(shù)結(jié)合菌株發(fā)酵特性，在酒類生產(chǎn)的質(zhì)量控制方面起到積極作用 （7）TLC薄層層析 TLC薄層層析技術(shù)應用于微生物菌種鑒定，進行細菌、放線菌細胞壁化學組分分析（氨基酸、糖），作為劃分屬特征的重要鑒定技術(shù)手段，起到了良好的輔助作用。 （8）全細胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng) 采用Sherlock全自動細菌鑒定系統(tǒng)，通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進行分析，并與標準數(shù)據(jù)庫進行比對，來鑒定細菌及酵母。該技術(shù)是細菌或酵母種水平鑒定的有效手段之一。 （9）（GC）mol及DNA/DNA雜交采用DU

31、800核酸蛋白分析儀測定Tm值，從而得到微生物菌株的（GC）mol，并與模式菌株進行DNA/DNA同源性分析，該鑒定技術(shù)手段是多相鑒定的重要組成部分。三、實驗材料1、器材：電子天平、帶有玻璃珠的三角瓶、搖床、1mL的無菌吸管、10mL的刻度試管、無菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH試紙、封口膜、記號筆、線繩、紗布、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌器、稱量紙、藥匙、試管架、涂布棒、酒精燈、超凈工作臺、火柴。2、試劑和材料：無菌牛皮紙袋、無菌鏟、標簽、打孔器，鑷子，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·

32、3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸餾水、新鮮馬鈴薯、10%酚酞、乳酸。四、實驗步驟（一）菌落形態(tài)（群體形態(tài)）的觀察觀察不同細菌、放線菌、真菌生成菌落的形態(tài)特點。觀察內(nèi)容主要有菌落大小、形狀、表面、質(zhì)地和顏色等方面。其中，菌落的大小可量取其直徑；形狀指圓形或不規(guī)則形等；表面指凸起或平展、有無光澤以及是否光滑等；質(zhì)地指粘、脆而言，可用接種針挑取菌落，試驗是否容易挑取。（二）細胞形態(tài)（個體形態(tài)）觀察1、細菌細胞形態(tài)觀察（1）區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、有無鞭毛和糖被；（2）觀察細菌的形狀（如球形、桿形、螺旋形等）；（3）菌體排列方式。革蘭氏染色步驟：（1

33、） 涂片取滅過菌的載玻片于實驗臺上，用移液槍吸取10ul待檢樣品滴在載玻片的中央， 用燒紅冷卻后的接種環(huán)將液滴涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。（2） 干燥將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水 分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。（3） 固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰處盡快的來回 通過2-3次，共約2-3秒種，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60），放置待冷后，進行染色。（4） 初染 加草酸銨結(jié)晶紫染色液一滴，染色約1 min，水洗。水洗時用木炭夾夾住載玻片的一端，斜置載玻片，用細小

34、的緩水流自標本的上端流下，洗去多余的染料，勿使水流直接沖洗涂菌處，直到流下的水為無色為止。將標本置于桌上風干，也可用吸水紙輕輕地吸去水份，或微微加熱，以加快干燥速度。（5） 媒染 滴加碘液沖去殘水，復染約1 min，水洗。 （6） 脫色 將載玻片上的水用吸水紙輕輕地吸干凈，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030 s，立即用水沖凈酒精。 復染用番紅染色液染23 min，水洗，干燥。（7） 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。鞭毛染色步驟：鞭毛染色硝酸銀染色法 硝酸銀染色液配制如下：

35、A液：單寧酸5.0g，F(xiàn)eCl3 1.5g，福爾馬林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸餾水100mL。 B液：AgNO3 2.0g,蒸餾水100mL。（1） 載玻片準備：將載玻片用洗衣粉洗滌后，置于95%的乙醇溶液中浸泡20min，使用時取出再火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。（2） 制片：取一塊載玻片，在一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)無菌操作從斜面上挑取菌種在載玻片液滴上輕輕蘸一下，使液滴表面形成一薄層菌膜，隨后傾斜玻片，使懸菌液緩慢流向另一端，用吸水紙在載玻片邊緣處吸去多余菌懸液，自然干燥。（3） 染色：滴加硝酸銀染液A液覆蓋菌面3-5min后用蒸餾水充分洗去A液，之后用B液洗

36、去殘留水分，再滴加B液覆蓋菌面數(shù)秒至1min，其間可用微火加熱，當菌面出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。（4） 鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查，菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。莢膜染色步驟：推薦以下四種染色法，其中以濕墨水方法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細菌。如用相差顯微鏡檢查則效果更佳。 負染色法： （1）制片：取潔凈的載玻片一塊，加蒸餾水一滴，取少量菌體放入水滴中混勻并涂布。 （2）干燥：將涂片放在空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。 （3）染色：在涂面上加復紅染色液染色23min。 （4）水洗：用水洗去復紅染液。 （5）干燥：將染色片放空氣中晾干或用電吹風冷風吹干。 （6）涂黑素

37、：在染色涂面左邊加一小滴黑素，用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素，使黑素沿玻片邊緣散開，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成為一薄層，并迅速風干。 （7）鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡觀察。 結(jié)果：背影灰色，菌體紅色，莢膜無色透明。 濕墨水法 （1）制菌液：加1滴墨水于潔凈的載玻片上，挑少量菌體與其充分混合均勻。 （2）加蓋玻片 放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸去多余的菌液。 （3）鏡檢：先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。 結(jié)果：背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。干墨水法 （1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端，挑少量膠質(zhì)芽胞桿菌與其充分混合，再

38、加1環(huán)墨水，充分混勻。 （2）制片：左手執(zhí)玻片，右手另拿一邊緣光滑的載玻片，將載玻片的一邊與菌液接觸，使菌液沿玻片接觸處散開，然后以30度角，迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端，使菌液鋪成一薄膜。 （3）干燥：空氣中自然干燥。 （4）固定：用甲醇浸沒涂片，固定1 min，立即傾去甲醇。 （5）干燥：在酒精燈上方，用文火干燥。 （6）染色：用甲基紫染12min。 （7）水洗：用自來水輕洗，自然干燥。 （8）鏡檢：先用低倍鏡再高倍鏡觀察。 結(jié)果：背景灰色，菌體紫色，莢膜呈一清晰透明圈。 Tyler法 （1）涂片：按常規(guī)法涂片，可多挑些菌體與水充分混合，并將粘稠的菌液盡量涂開，但涂布的面積不宜過大。

39、（2）干燥：在空氣中自然干燥。 （3）染色：用Tyler染色液染57min。 （4）脫色：用20%CuSO4水溶液洗去結(jié)晶紫，脫色要適度（沖洗2遍）。用吸水紙吸干，并立即加12滴香柏油于涂片處，以防止CuSO4結(jié)晶的形成。 （5）鏡檢：先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。觀察完畢后注意用二甲苯擦去鏡頭上的香柏油。 結(jié)果：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。2、放線菌細胞形態(tài)觀察插片法觀察放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲以及孢子絲的著生狀態(tài)，并繪圖。（1）倒平板將高氏1號培養(yǎng)基熔化后，倒1012 mL左右于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后使用。    （2）插片將滅菌的蓋玻片以45度角插入

40、培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基中，插入深度約為蓋玻片的1/2或1/3。 （3）接種與培養(yǎng)用接種環(huán)將菌種接種在蓋玻片與瓊脂相接的沿線，放置28 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)37 天。（4）觀察培養(yǎng)后菌絲體生長在培養(yǎng)基及蓋玻片上，小心用鑷子將蓋玻片抽出，輕輕擦去生長較差的一面的菌絲體，將生長良好的菌絲體面向載玻片，壓放于載玻片上。直接在顯微鏡下觀察。 3、霉菌細胞形態(tài)觀察水浸片法觀察霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲以及氣生菌絲的特化狀態(tài)，并繪圖。水浸片法（1） 制片取干凈載玻片一張，于中央滴加乳酸石碳酸棉藍液一滴，用解剖針從菌落邊緣劃取菌絲體一小塊，放入乳酸石碳酸棉藍液中，小心地加蓋玻片一張，并輕壓蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）（2） 鏡檢在

41、低倍鏡或高倍鏡下觀察。觀察時注意菌絲體有無隔膜、假根、足細胞等特殊構(gòu)造，并觀察孢子的形態(tài)、大小和著生方式。（三）生理生化特性鑒定1、細菌由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的鑒定中，生理生化試驗占有重要的地位。(1) 淀粉水解試驗：在含2%淀粉的牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基上接種細菌，培養(yǎng)兩天以后，再往培養(yǎng)基中加碘液染色，若該細菌能分泌胞外淀粉酶，則能利用其周圍的淀粉，淡然在染色后，其菌落周圍不呈藍色，而是無色透明圈。 (2) 糖發(fā)酵試驗：不同的細菌分解糖的能力不同，

42、有些細菌能利用糖發(fā)酵產(chǎn)酸和產(chǎn)氣，有些則不能。酸在加入溴甲酚紫指示劑后會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。 操作步驟：A、用記號筆在各試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細菌菌名。 B、取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管多支，分別接入各待測菌 并做一支不接種的對照。 在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。 C、將接種過和作為對照的6支試管均置37培養(yǎng)2448h。D、觀察德漢氏小管中有無氣泡并加入指示劑后觀察各試管顏色變化。IMVC實驗用來測定菌的生理生化特征的4個實驗，I:吲哚試驗；M: 甲基紅試

43、驗； V:V.P.試驗；C:檸檬酸實驗，主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。 （1） 吲哚試驗： 試驗菌用蛋白胨水培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時. 在培養(yǎng)液中加入乙醚1ml(使呈明顯的乙醚層)充分振蕩,使吲哚試劑溶于乙醚.靜置片刻,待乙醚浮于培養(yǎng)液上面時沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴.呈玫瑰紅的為陽性,不變色的為陰. (注:加入吲哚試劑后,不可再搖動,否則紅色不明顯) （2） 甲基紅試驗（MR）：某些細菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進而被分解產(chǎn)生甲酸，乙酸和乳酸等多種有機酸，使培養(yǎng)液pH值降至4.5以下，加入甲基紅后溶液呈紅色。 試驗菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時。 沿管壁加入M.

44、R.(甲基紅)試劑3-4滴.紅的為陽性,黃的為陰性。（3） V.P.試驗 試驗菌用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基37培養(yǎng)24小時。 加入40%KOH 10-20滴,再加入等量-茶酚,用力振蕩(拔去棉塞)再放入374h后再觀察,仍無色產(chǎn)生為陰。 （4） 檸檬酸實驗 將試驗菌培養(yǎng)在檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上37培養(yǎng)24-28小時. 觀察有無細菌生長與培養(yǎng)基顏色變化.如果含有溴麝香草酚藍的斜面藍色者為陽性反應,呈綠色的為陰性反應;含苯酚紅的斜面如果呈紅色為陽性反應,呈黃色為陰性反應. 2、放線菌牛奶凝固與胨化：將供試放線菌接入滅菌脫脂牛奶中，28下培養(yǎng)，在5、10、15、20、25d各觀察1次。參考對照記錄凝固和胨化

45、情況。明膠液化：將供試放線菌菌種接種于滅菌明膠培養(yǎng)基表面。28下培養(yǎng)，在5、10、20、30d各觀察1次。觀察前將試管在自來水槽中冷卻20min。待對照完全凝固后，再觀察記錄其液化過程。淀粉水解：用點接法將供試放線菌菌種點接在淀粉水解培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7d后，將碘液滴在培養(yǎng)基上。測量菌落和水解圈直徑。纖維素分解：將菌種接種在試管中的一半浸在無碳源合成培養(yǎng)基內(nèi)的濾紙條上，28下培養(yǎng)，第30天時觀察。（三）分子生物學鑒定菌種鑒定一般就只要提取基因組DNA，然后PCR擴增16srDNA片段，上GeneBank對比即可。一般序列相似度在97%以上就可以認為是同種細菌（當然也有例外，DNA序列僅僅是一個

46、參考指標）細菌基因組DNA的提取與純化（1）搖菌過夜30、180r/min搖床振蕩培養(yǎng)812h； （2）沉淀菌體，取菌液于1.5mL EP管中5000r/min離心5min，無菌水洗滌12次；（3）400L TE重懸菌體，加入20L溶菌酶（50mg/ml），37過夜；（4）加400L CTAB提取液，輕輕搖勻，65水浴40min（每10min輕搖一次）；（5）冷卻至室溫，加400L酚-氯仿(1:1)，輕輕搖勻，12000r/min，4離心10min；（6）吸取上層清液，加400L氯仿，輕輕搖勻，12000r/min，4離心10min；（7）吸取上層清液，加入等體積冰凍異丙醇，輕輕搖勻，-20靜

47、置30min24h沉淀DNA，12000r/min，4離心20min；（8）小心倒掉水相，75%乙醇洗滌2次，風干。（9）200L TE溶解沉淀，加入20L RNA酶（20mg/ml），37保溫30min，以等體積的酚-氯仿和氯仿各抽提一次；（10）吸取上清液，加入1/10體積3mol/L NaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕搖勻至出現(xiàn)絮狀沉淀，1000r/min離心30min；（11）倒掉上清液，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，風干。加入2030L TE緩沖液，-20保存待用。16S rDNA的擴增和序列測定將提出的基因組DNA進行瓊脂糖電泳檢測，驗證有目的產(chǎn)物后，用特定的引物進

48、行16S rDNA的分離及PCR擴增，并電泳檢測，將樣品放入4保存待用。擴增條件：Step1945 minStep29430 secStep35740 secStep47290 secStep5GOTO Step232循環(huán)Step67210 min擴增體系：樣品DNA1 L10×Taq buffer1.5 L2.5 mmol/L dNTP1.3 L引物1：1495 R0.5 L引物2：27 F0.5 LTaq酶（2.5 U/µL）0.4 L加雙蒸水15 L（四）菌種的長期保藏無論采用何種保藏方法，首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽

49、孢等。其次，應根據(jù)微生物生理、生化特點，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。1、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞

50、代替棉塞，再用石蠟封口，置于4冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。該法的優(yōu)點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。2、石蠟油封藏法此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無毒，化學純規(guī)格，其滅菌條件是：150170烘箱內(nèi)

51、滅菌lh；或121高壓蒸汽滅菌6080min，再置于80的烘箱內(nèi)烘干除去水分。由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達12年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。3、砂土管保藏法這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩(一般砂

52、用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(12)：1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121蒸汽滅菌11.5h，間歇滅菌3次。50烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成1081010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約24h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約110年。

53、中國科學院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。4、麩皮保藏法麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：(0.81.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經(jīng)濟實惠，工廠較多采用。中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，

54、其保藏期可達數(shù)年至數(shù)十年。5、冷凍真空干燥保藏法冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達515年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細

55、菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設備。保藏菌種需用時，可在無菌環(huán)境下開啟安瓿管，將無菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復水，然后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養(yǎng)即可。6、甘油管低溫保藏法A、將要保存菌種接種于LB液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期（肉眼見培養(yǎng)體系內(nèi)渾濁即可）；B、將甘油稀釋至濃度為50%（等體積蒸餾水加等體積甘油，甘油需要慢慢吸）；C、將甘油、2 ml離心管、槍頭等試驗用品于121滅菌20minD、無菌條件下將菌液與50%濃度甘油1:1等體積混合于離心管中，甘油終濃度為25% 5 于-20或-80冰箱內(nèi)保存7、液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1/min 的速度從0直降到-35，然后保藏在-150-196液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細胞