腦和脊髓損傷對骨折股骨骨痂中NGF表達影響

1、腦和脊髓損傷對骨折股骨骨痂中NGF表達影響 作者：郭靜芹 徐進亮 梁愛琴 崔瑞耀【關鍵詞】 脊髓 摘要 目的 研究大鼠腦和脊髓損傷后骨折股骨骨痂中神經(jīng)生長因子（NGF）表達的變化。方法 成年健康雌性Wistar大鼠48只，隨機分為單純股骨骨折組、股骨骨折并腦損傷組和股骨骨折并脊髓損傷組，每組16只，每組再分為骨折后1、4、7、14 d觀察組。應用自由墜落重物撞擊法建立腦和脊髓損傷動物模型，免疫組織化學方法檢測各組骨痂中NGF的表達。結果 單純骨折組表現(xiàn)為典型的骨折愈合過程，骨痂內(nèi)纖維母細胞及成骨細胞內(nèi)NGF陽性表達相對較弱。骨折并腦損傷組早期纖維性骨痂形成較慢，骨折早期骨痂內(nèi)成纖維細胞及成骨細

2、胞NGF表達較弱，第14天表達增強，出現(xiàn)成骨細胞。骨折并脊髓損傷組早期形成大量纖維骨痂和軟骨骨痂，NGF強陽性表達，第14天已有編織骨形成，NGF表達達高峰。結論 并發(fā)脊髓損傷的股骨骨折愈合較快，NGF表達明顯增強，提示NGF可能具有促進骨折愈合的作用。 關鍵詞 腦損傷；脊髓損傷；股骨骨折；神經(jīng)生長因子；大鼠，Wistar ABSTRACTObjectiveTo study the expressive change of nerve growth factor (NGF) in bony callus after fracture of the thighbone in rats with

3、cerebral and spinal cord injury. MethodsFortyeight adult healthy female Wistar rats were randomly divided into thighbonefracture group (n=16), thighbonefracturewithcerebralinjury group (n=16) and thighbonefracturewithspinalcordinjury group (n=16). Each group was further divided into postfracture (on

4、eday, fourday, sevenday and 14day) subgroups, with four rats in each subgroup. The animal models were established by free weight dropping and knocking method, expressions of NGF in bony callus were determined by immunohistochemical assay. ResultsThe animal models in simple fracture group appeared a

5、typical healing course, NGF expressed weakly in fibroblast and chondroblasts in callus. In fracture with cerebral injury group, the callus formed slowly and NGF expressed weakly at early stage of fracture, but increased and appeared chondroblasts at 14 days. In fracture with spinal cord injury group

6、, there was a quantity of fibrous callus and cartilaginous callus formation and NGF positive expression at early stage, and bone formation with NGF highest expression at 14 days. ConclusionThe thighbone fracture recovers rapidly and NGF in the callus expresses highly in fracturewith spinalcordinjury

7、 group, which suggests that NGF could yield the healing of the fracture. KEY WORDSbrain injuries; spinal cord injuries; femoral fractures; nerve growth factors; rats, Wistar 臨床上，四肢骨折并發(fā)腦和脊髓損傷時，骨折處骨痂過度生長，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，骨折愈合明顯快于單純的四肢骨折。臨床和實驗研究表明，骨的生長、修復受神經(jīng)因素的影響，感覺和自主神經(jīng)纖維分布在骨及骨膜上，其釋放的神經(jīng)肽在骨折愈合重建中發(fā)揮重要作用。本實驗

8、采用大鼠股骨骨折并發(fā)腦或脊髓損傷動物模型，應用免疫組織化學法研究股骨骨折后不同時間點骨痂的變化和骨痂中神經(jīng)生長因子（NGF）的表達，探討中樞神經(jīng)損傷對骨折愈合的影響和機制。 1 材料與方法 1.1 動物分組 成年健康雌性Wistar大鼠48只，8月齡，體質量290340 g，清潔級，由同濟醫(yī)科大學動物中心提供。隨機分為單純股骨骨折組16只、股骨骨折并腦損傷組16只和股骨骨折并脊髓損傷組16只，每組再分為骨折后1、4、7和14 d等4個觀察組，每組4只大鼠。 1.2 動物模型的建立 應用自由墜落重物撞擊法建立腦或脊髓損傷動物模型1。1期郭靜芹，徐進亮，梁愛琴，等腦和脊髓損傷對骨折股骨骨痂中NGF

9、表達影響35 1.2.1 單純股骨骨折組 將大鼠用100 g/L的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上。常規(guī)消毒，無菌操作，取股外側縱行切開1 cm，經(jīng)股前、外側肌間隔分離至股骨，用線鋸切斷股骨中段，然后行克氏針髓腔逆行固定，逐層縫合切口，消毒包扎。術后放置籠中，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動與取食。 1.2.2 股骨骨折并腦損傷組 完成上述手術后，在顱頂沿正中線切開皮膚，顯露右頂骨，于中線旁2 mm處用骨鉆鉆開直徑5 mm骨窗，暴露硬腦膜。將動物置于重力打擊裝置下，用質量20 g的金屬砝碼于30 cm高處，通過玻璃導向管自由墜落，撞擊置于硬腦膜上的圓柱形撞擊桿，造成中度腦損傷

10、。迅速移開打擊裝置，逐層縫合切口，消毒包扎。其中有3只大鼠撞擊后當場死亡，死亡的大鼠再補齊。術后放置籠中，每8 h擠尿1次，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動與取食。 1.2.3 股骨骨折并脊髓損傷組 完成股骨骨折手術后，于動物背部常規(guī)消毒，無菌操作，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離棘突旁肌肉，切除第7胸椎棘突及椎板，暴露硬脊膜。將動物置于重力打擊裝置下，用質量20 g的金屬砝碼于5 cm高處，通過玻璃導向管自由墜落，撞擊置于硬脊膜上的圓柱形撞擊桿，造成中度脊髓損傷。迅速移開打擊裝置，逐層縫合切口，消毒包扎。應用改良Tarlov評分法測評大鼠后肢運動功能狀況2。 1.3 標本采集和切片制備 各組動物在規(guī)定的觀察時

11、間點分批麻醉后，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水200 mL和40 g/L多聚甲醛300 mL。立即在無菌操作下，沿骨折部位上、下各1 cm處用線鋸截取股骨，置于40 g/L多聚甲醛中后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，然后放入質量分數(shù)為0.20乙二胺四乙酸二鈉中34周，充分脫鈣（以用針頭能輕易扎穿骨皮質為宜）。修剪股骨標本長約1 cm，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿股骨長軸縱行連續(xù)切片，片厚7 m，粘于多聚賴氨酸處理的切片上，置4 冰箱中備用。 1.4 蘇木精伊紅染色切片染色后，細胞核呈藍色，細胞漿呈淡紅色。 1.5 免疫組織化學染色 兔抗鼠NGF多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒

12、購于武漢博士德生物工程有限公司。按照試劑盒說明操作，DAB顯色，觀察骨痂組織成骨細胞及纖維母細胞內(nèi)NGF表達情況，細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。陰性對照以0.1 mmol/L的PBS代替一抗，不出現(xiàn)陽性著色。 1.6 陽性細胞數(shù)和吸光度的檢測 每個標本在高倍鏡（400倍）下隨機觀察骨痂處4個不重疊的視野，應用WIDAS21圖像分析系統(tǒng)計算每個視野陽性細胞數(shù)。 2 結 果 2.1 組織學觀察 2.1.1 單純骨折組 表現(xiàn)為典型的骨折愈合過程，骨痂呈梭形向外膨脹，骨膜反應輕，纖維骨痂量少，膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨并存，以前者為主。骨折第4天骨膜開始增厚，骨膜內(nèi)形成的軟骨細胞及纖維母細胞的量逐漸增多

13、。隨著時間的延長，成骨細胞增多，骨痂層逐漸增厚，至骨折第14天已形成典型的骨小梁結構。 2.1.2 股骨骨折并腦損傷組 早期表現(xiàn)為血腫和炎性滲出增多，成纖維細胞和軟骨細胞較少；骨折第7天成纖維細胞和軟骨細胞開始增多；第14天出現(xiàn)成骨細胞及纖維性骨痂形成。 2.1.3 股骨骨折并脊髓損傷組 骨折第1天表現(xiàn)為血腫和炎性滲出反應，骨膜明顯增厚；第4天開始骨膜內(nèi)層形成軟骨細胞，成纖維細胞明顯增多，形成纖維性骨痂；第7天纖維骨痂中的軟骨細胞團增大，有的融合在一起，軟骨內(nèi)骨化少，骨膜下軟骨細胞層增厚；第14天仍可見大量纖維骨痂和軟骨骨痂，軟骨細胞團周邊有少量結構稀疏的編織骨形成，外骨膜下的軟骨層尚未完全轉

14、變成編織骨。 2.2 免疫組織化學觀察 單純股骨骨折組，骨折后骨痂內(nèi)成纖維細胞及成骨細胞NGF呈陽性表達，陽性細胞數(shù)相對較少，骨折第114天陽性細胞數(shù)無明顯變化。骨折并腦損傷組，骨折第17天骨痂內(nèi)成纖維細胞及成骨細胞NGF表達較弱，陽性細胞數(shù)很少，第14天表達增強。骨折并脊髓損傷組，骨折第4天骨痂內(nèi)成纖維細胞及成骨細胞NGF表達增強，第7天陽性細胞數(shù)明顯增多，第14天達高峰。骨折并脊髓損傷組第4、7、14天，骨折并腦損傷組第14天陽性細胞數(shù)與單純股骨骨折組比較差異有顯著性（F=3.246.87,q=3.567.15,P<0.05）。見表1。 3 討 論 表1 各組骨痂中NGF陽性

15、細胞數(shù)測定結果（略） NGF是一種含118個氨基酸的多肽激素，是神經(jīng)生長因子家族的成員。1990年FRENKEL等3首次報道了雞胚的軟骨和骨細胞內(nèi)有NGF，并采用免疫組織化學方法檢測了不同時期雞胚組織的NGF表達情況，發(fā)現(xiàn)614 d NGF表達陽性，超過17 d表達陰性，認為骨折愈合過程與胚胎骨形成相似，骨痂內(nèi)和其他未成熟組織可能產(chǎn)生NGF，以誘導神經(jīng)纖維長入骨痂中。本實驗結果表明，脊髓損傷組早期骨痂形成量較單純骨折組高，714 d達高峰，說明脊髓損傷后可使骨痂形成明顯增多。免疫組織化學染色顯示，脊髓損傷組早期骨膜下大量纖維母細胞和成骨細胞內(nèi)NGF強陽性表達。據(jù)此推測，由于脊髓損傷后早期骨痂內(nèi)

16、NGF強陽性表達，刺激纖維骨痂和軟骨骨痂大量形成，參與骨折愈合過程。腦損傷組早期骨痂形成量少，骨膜下纖維母細胞和成骨細胞內(nèi)NGF弱陽性表達，其影響因素可能與打擊量過大，對腦組織造成過于嚴重的損傷有關，腦組織的損傷程度和NGF水平之間的關系有待于進一步的研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷后NGF影響骨折愈合可能機制如下。NGF與受體結合：由于成骨細胞膜上有NGF的受體4，內(nèi)源性與外源性NGF可與其結合，使成骨細胞發(fā)生磷酸化過程，增強骨細胞活性，成骨能力增強，促進骨折愈合。NGF引導神經(jīng)長入骨痂：GRILLS等5研究證明，骨痂中骨祖細胞、成骨細胞等可產(chǎn)生NGF，NGF可誘導交感和感覺神經(jīng)纖維長入骨痂，這些神經(jīng)

17、纖維可釋放神經(jīng)肽遞質，有抑制骨吸收作用。它還能通過刺激細胞有絲分裂和骨基質細胞分化刺激骨形成，由于NGF可能通過增加交感神經(jīng)的支配間接增加血管的生成，從而促進骨化。NGF促進P物質（SP）、降鈣素基因相關肽（CGRP）的釋放：MALCANGIO等6研究顯示，NGF能刺激大鼠脊髓SP、CGRP的釋放，其釋放的方式可沿軸漿轉運到骨折局部，通過旁分泌釋放，也可通過血液以內(nèi)分泌方式到達骨折局部，刺激成骨。NGF在骨組織對1,25二羥基維生素D31,25(OH)2D3的攝取過程中起調節(jié)作用：1,25(OH)2D3在骨代謝過程中非常重要，而在成骨細胞的培養(yǎng)基中加1,25(OH)2D3可使成骨細胞表達NGF

18、4，反過來NGF可能調節(jié)骨組織對1,25(OH)2D3的攝取。 參考文獻1郭云良主編. 神經(jīng)生物學技術M. 青島: 中國海洋大學出版社, 2005:3437.2CHENG H, CCAOY , OLSON L. Spinal cord repair in adult paraplegia rats: partial restoration of hind limb functionJ. Science, 1996, 273 (5274):510.3FRENKEL S R, GUERRA L A, MITCHELL O G, et al. Nerve growth factor in skeletal tissues of the embryonic chickJ. Cell Tissue Res, 1990,260 (3):507.4JEHAN F, NAVEILHAN P, NEVEU I, et al. Regulation of NGF, BDNF and NGFR gene expression in Rosl7/2.8 cellsJ. Mol Cell Endocrinol, 1996, 116(2):149.5GRILLS B L, SCHUIJERS J A. Immunohistochemical localizat