表沒食子兒茶素沒食子酸酯測定及其對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用研究

1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯測定及其對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用研究 作者：張鳳，安利國，李福榮，趙曉民，文今福，楊桂文【摘要】 目的分析表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在綠茶提取物中的含量，探討EGCG對人胃癌細(xì)胞BGC823增殖和凋亡的影響，為闡明EGCG抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定綠茶提取物中EGCG的含量。MTT法檢測EGCG對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞BGC823增殖的影響;DNA ladder法檢測EGCG處理各組DNA梯度的變化。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)比較采用t-test。結(jié)果通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定綠茶提取物中EGCG 的

2、含量為9%。MTT法檢測結(jié)果顯示EGCG能夠呈現(xiàn)劑量(5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2)g/L依賴性地抑制人胃癌細(xì)胞BGC823的增殖;DNA ladder法顯示EGCG處理組細(xì)胞DNA呈現(xiàn)梯狀條帶，而對照組則沒有這種帶紋。結(jié)論綠茶提取物中EGCG的含量為9%;EGCG能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制人胃癌細(xì)胞BGC823的生長和增殖。 【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜; 表沒食子兒茶素沒食子酸酯; 胃癌細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡Abstract：ObjectiveTo analyze the content of Epigallocatechin g

3、allate(EGCG)in green tea extraction and to investigate the effect of EGCG on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer cells BGC823 cultured in vitro,which provide experimental basis for clarifying the mechanism of antitumor effect of EGCG.MethodsIn the condition of mobile phase double

4、 distilled water / acetonitrile / ethyl acetate (86122 v / v / v), a flow rate of 1.0 ml / min, RP-HPLC Chromatogram was used to study EGCG in green tea. Human gastric cancer cells BGC823 cultured in vitro were treated with different concentrations of EGCG, and then the absorbencyon at 490 nm of the

5、 cells in each group was examined by MTT method. DNA ladder assay was used to detect the apoptosis of BGC823.Statistical analysis was performed by SPSS12.0 and t test was used to compare the mean value between the different groups.ResultsThere was 9% EGCG in green tea extraction calculating by drawi

6、ng standard cure. After treatment with different concentrations of EGCG, as measured by MTT assay ,cell viability decreased in a dose- (5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2g/L) dependent manner(showed as figure 2). DNA ladder assay showed that DNA of the cells treated with EGCG showed the

7、 characteristics of apoptosis-DNA ladder,while the control group did not have such strip.ConclusionThere was 9% EGCG in green tea.EGCG can inhibit the growth and proliferation of gastric cancer cells BGC823 by inducing its apoptosis.Key words：RP-HPLC; EGCG; Gastric cancer cell; Cell apoptosis歷史上茶曾被作

8、藥用。近些年,茶及其組分對人體健康的潛在益處使得對茶的研究越來越廣泛。茶尤其是綠茶，含有特殊的多酚物質(zhì),主要是兒茶素1。兒茶素是以兒茶為主體結(jié)構(gòu),與沒食子酸基團(tuán)結(jié)合形成的一類活性物質(zhì),其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate ，EGCG)是綠茶兒茶素中含量最高的一種,占50%左右，其它幾種茶多酚化合物在綠茶中的含量相對較低,包括表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG)和表兒茶素(epicatechin,EC)2。研究表明3，4, EGCG具有很強(qiáng)的抗腫瘤生長、抗癌侵

9、襲轉(zhuǎn)移等活性。此外,它也用作腫瘤多重耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑,能夠改善許多癌細(xì)胞對化療的敏感性并減輕對心臟的毒性5。據(jù)此我們推測EGCG能夠抑制細(xì)胞增殖從而抑制胃癌細(xì)胞的生長，在胃癌治療中發(fā)揮有益的作用。我們研究日照綠茶中EGCG的含量及其對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用，以期探討綠茶是否也有著廣泛的生物學(xué)作用，為進(jìn)一步開發(fā)綠茶的應(yīng)用價(jià)值提供基礎(chǔ)資料。1 材料與儀器BGC823細(xì)胞株(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院);EGCG(Sigma 公司);RPMI 1640干粉(GIBCO);小牛血清(四季青生物工程材料有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司);青霉素(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心);鏈霉素(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中

10、心);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);高效液相色譜分析儀(HPLC)(美國Agilent公司);熒光顯微鏡 (Leica);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠); 微波爐(廣東順德);Model 550 酶標(biāo)儀( BIO-RAD 美國);凝膠成像系統(tǒng)(Tu-20，美國)。2 方法2.1 高效液相色譜法測定綠茶中EGCG含量2.1.1 高效液相色譜條件色譜柱為C18 ，監(jiān)測器：紫外監(jiān)測波長(280 nm);流動(dòng)相為雙重蒸水/乙腈/乙酸乙酯(86122 V/V/V)，流速：1.0 ml/min。2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取EGCG 0.010 0 g，用雙蒸水溶解于10 ml容量

11、瓶中，經(jīng)微孔濾膜過濾作為母液，通過梯度稀釋得到終濃度為(0.0050，0.0025，0.0013，0.0006，0.0003)g/ml的EGCG待測溶液。2.1.3 樣品中EGCG含量的測定準(zhǔn)確稱取綠茶提取物0.010 0 g，用雙蒸水溶于10 ml容量瓶中，經(jīng)微孔濾膜過濾作為待測樣品。2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法檢測細(xì)胞增殖情況BGC823細(xì)胞株購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，置于含10%胎牛血清的RPMI -1640培養(yǎng)體系中，在37，50 ml/L CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞BGC823以5×107/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板, 每孔100 l, 37, 50 ml

12、/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后分別接入不同濃度的無菌EGCG溶液100 l, 使最終濃度分別為5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2 g/L, 各組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔, 對照組加100 l培養(yǎng)液, 在37, 50 ml/L CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 實(shí)驗(yàn)終止前加入新配制的5 g/L的MTT溶液20 l,混勻, 再繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 棄去上清液,每孔加DMSO 200 l,充分振蕩30 min, 溶解MTT沉淀物, 490 nm測定每孔的吸光度A值。 計(jì)算抑制率: 抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。2.3

13、 DNA梯度檢測細(xì)胞凋亡將1×108/L細(xì)胞接種于9個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中, 24 h后加入無菌EGCG溶液, 使每3皿終濃度為2×10-2, 3×10-2，4×10-2g/L, 對照組加等量的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞用1 ml冰冷的PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)1次，細(xì)胞按以下步驟抽提DNA：加消化緩沖液1ml，再加入蛋白酶K(20 mg/ml)15l在55消化3 h。11酚/氯仿抽提，離心7 000 r/min，15min。再用氯仿抽提一次(注意操作動(dòng)作

14、要輕)。取上清(不要攪動(dòng)液面)，移入干凈EP管中。加入0.1體積的NaAc，(pH 5.2，5 mol/L),再加入2倍體積無水乙醇，小心混勻，-20過夜沉淀DNA，12 000 r/min離心5 min。用70%乙醇洗滌2次，12 000 r/min離心5 min，倒凈EP管中乙醇，待乙醇痕量揮發(fā)，加入50 l雙蒸水溶解。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡梯度。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和t-test處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。3 結(jié)果3.1 RP-HPLC法測定綠茶提取物中EGCG含量3.1.1 EGCG的高效液相色譜圖譜見圖1。圖1 標(biāo)準(zhǔn)品EGCG的高效液相

15、色譜圖譜由圖1確定EGCG在實(shí)驗(yàn)色譜條件下的保留時(shí)間約為9.097min。3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制檢測各個(gè)濃度的EGCG的峰面積，每個(gè)濃度重復(fù)3次，得回歸方程為Y=21222X-688.27Y為峰面積，X為EGCG濃度(0.35.0 mg/ml)，R2=0.996 5。3.1.3 樣品中EGCG含量的測定通過與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間對比，可知出峰時(shí)間為9.056 min的峰為EGCG。重復(fù)3次5 mg/ml樣品的高效液相色譜，得樣品EGCG峰面積平均值為8766.1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知5 mg樣品中EGCG含量為0.45 mg，即綠茶提取物中EGCG含量為9%。3.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況EGC

16、G對胃癌細(xì)胞BGC823的生長有很強(qiáng)的抑制作用，而且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見圖2。圖2 EGCG對胃癌細(xì)胞BGC823的生長抑制作用3.3 DNA梯度檢測細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活, 其DNA在核小體之間的連接處被切斷,降解為180200 bp的或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)階梯狀條帶(DNA ladder) 。(2×10-2, 3×10-2，4×10-2)g/L EGCG作用于胃癌細(xì)胞后,采用瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,可見明顯的DNA ladder凋亡帶,對照組細(xì)胞則無此凋亡梯狀條帶。見圖3。4 討論胃癌是我國常見的腫瘤之一,

17、 為全部惡性腫瘤的第3位, 占消化道腫瘤的首位。胃癌的死亡率相當(dāng)高, 是各種惡性腫瘤中的第1位。雖然近年來胃癌在我國的發(fā)病率有降低趨勢, 但作為重大疾病, 胃癌的防治形勢依舊十分嚴(yán)峻, 亟待發(fā)掘新的有效的治療策略。綠茶是三大茶系之一,綠茶多酚占綠茶干重的30%, 大多數(shù)是兒茶素。許多流行病學(xué)研究都表明飲用綠茶同眾多部位發(fā)生腫瘤的危險(xiǎn)度偏低相關(guān), 尤其是胃、食管、卵巢和乳腺等6，7。實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法測定日照綠茶提取物中EGCG含量，確定其中含有EGCG且含量為9%，觀察EGCG對人胃癌細(xì)胞BGC823的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)EGCG能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制其生長和增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示, 服

18、用綠茶提取物或茶多酚能抑制裸鼠的乳腺癌和前列腺癌的生長8，9。流行病學(xué)及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相輔相成地提示我們綠茶對胃癌治療可能有一定的療效。因綠茶飲用在亞洲較為盛行,利用綠茶或綠茶成分預(yù)防和治療腫瘤極具前景。EGCG作為綠茶中的主要作用成分，是多效的生物活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。它可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制端粒酶活性及抑制生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)依賴性和酪氨酸激酶依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等發(fā)揮其作用1013。EGCG用于藥用具有毒性小，價(jià)格低廉，藥源充足等優(yōu)勢，很有開發(fā)前景。未來研究方向可著眼于：確定其特異性的靶向分子，提高其體內(nèi)的新陳代謝及生物利用度，發(fā)展同其他抗

19、腫瘤抑制劑的協(xié)同作用，提高腫瘤防治和治療的效率，減小其潛在的副作用等。【參考文獻(xiàn)】 1 朱發(fā)偉. 茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究進(jìn)展J.中草藥，2005，36(8)：1271.2 仉燕崍, 李 楠, 韓國柱,等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究進(jìn)展J.中草藥，2006，37(2)：303.3 Salma Hazgui,Arnaud Bonnomet,Beatrice Nawrocki-Raby, et al.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) inhibits the migratory behavior of tumor bronchial epithel

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