裸小鼠原位移植篩選高轉(zhuǎn)移性人骨肉瘤細(xì)胞系及其生物學(xué)特性分析

1、    裸小鼠原位移植篩選高轉(zhuǎn)移性人骨肉瘤細(xì)胞系及其生物學(xué)特性分析        摘要:目的在裸小鼠體內(nèi)篩選人骨肉瘤高肺轉(zhuǎn)移性細(xì)胞亞群，為實驗研究提供模型。方法利用原位移植方法，將人骨肉瘤細(xì)胞系SOSP?9607皮下移植瘤接種于裸鼠脛骨骨髓腔。篩選到第2代時，有1例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；以皮下擴增轉(zhuǎn)移灶，再次原位移植，第3代肺轉(zhuǎn)移率達(dá)83（5/6)。用組織塊法培養(yǎng)收集，比較其與母系在形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核型，vimentin，actin，NSE抗原表達(dá)及體積倍增時間等方面的差別。結(jié)果同母系相

2、比較,該轉(zhuǎn)移細(xì)胞保持了人骨肉瘤細(xì)胞的組織學(xué)特征，生物學(xué)特性也有較大差別。結(jié)論該細(xì)胞亞群是一株新建立的人骨肉瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移性亞系。關(guān)鍵詞：骨肉瘤；轉(zhuǎn)移；裸小鼠中號：R681.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：10078738(2000)03025203Screening of human osteosarcoma cell line with spontaneous highly pulmonary metastasis in nude mice by orthotopic transplantation and studies on its biological characteristics PAN

3、Zhao-huiFAN Qing-yuYIN Jian-ningJIANG Wei-zhongZHANG Dian-zhong（Institute of Orthopaedic Oncology of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China）Abstract: Aim To screen human osteosarcoma cell line with spontaneous highly pulmonary metastases i

4、n nude mice by an orthotopic transplantation and to provide a model for experimental study. Methods Osteosarcoma cell line SOSP? 9607 were inoculated in tibial marrow cavity of nude mice by subcutaneous injection of 107 cells ( 90 viable). Orthotopic transplantated, a cell line representive of passa

5、ge three with highly pulmonary metastases was obtained, characterized by light and electronic microscropy,karyotype, expressions of vimentin,actin and NSE, doubling time in vitro. Results After the third sequential or thotopic transplantation, a highly metastatic clone was obtained. Relatively to pa

6、rental cells, it remained histological characteristics of human osteosarcoma cells, but possessed more chromosome abnormalities. Conclusion A human osteosarcoma cell subpopulation with spontaneous highly pulmonary metastasis is established in nude mice. Keywords: osteosarcoma; metastasis; nude mice

7、骨肉瘤是一種危害性大、轉(zhuǎn)移率高的惡性腫瘤，雖然外科手術(shù)已經(jīng)顯著改善了保肢患者的生存質(zhì)量，但目前尚無很好的治療措施來控制和消除其轉(zhuǎn)移。實驗研究中迫切需要建立一種具有轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞模型。過去由于移植方法不當(dāng)，成功的例子不多。我們利用原位移植具有高成活率、高自發(fā)轉(zhuǎn)移率的特點1，將非轉(zhuǎn)移性人骨肉瘤細(xì)胞系SOSP?9607原位接種，成功地篩選出1株具有高肺轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞亞群SOSP-M1，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1材料Balb/c,nu/nu裸小鼠(購自中國生物藥品鑒定所)，鼠齡48wk,體重1520g，雌雄兼用。在本室裸鼠間SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。人骨肉瘤細(xì)胞系SOSP?9607，由

8、本所楊彤濤醫(yī)生建立，培養(yǎng)于含100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。抗波形蛋白(vimentin)和抗肌動蛋白(actin)的單克隆抗體(mAb),為Sigma公司商品化免疫試劑?？股窠?jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的mAb,為DAKO公司商品化免疫試劑。APAKit購自北京中山生物技術(shù)有限公司。1.2方法1.2.1自發(fā)性高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞的篩選復(fù)蘇第120代細(xì)胞，傳代培養(yǎng)5d后，用胰酶與EDTA混合液消化，以1×1011細(xì)胞/L·裸鼠，無菌條件下注射于其臀部皮下，此即為原代移植瘤(S0)。挑選對數(shù)生長期的S0中毛細(xì)血管豐富的瘤體，去除壞死組織，剪成0.5mm×0

9、.5mm大小備用。受體動物以0.20.3mL/只腹腔注射25g/L的硫賁妥鈉麻醉。于手術(shù)顯微鏡下(1.0×物鏡，10×目鏡)暴露脛骨結(jié)節(jié)，掀起0.5mm×0.5mm大小的骨皮質(zhì)瓣植入一塊瘤組織。骨瓣復(fù)位，用60號無創(chuàng)縫線縫合筋膜及皮膚。整個過程在無菌凈化室內(nèi)操作。8wk后，脫臼處死，于解剖顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。取脛骨瘤體(S1)再次原位移植，8wk后肉眼發(fā)現(xiàn)可見的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，皮下擴增轉(zhuǎn)移灶(S2)繼續(xù)接種，于相同時間處死并檢查轉(zhuǎn)移情況。通過組織塊法收集轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞(S3)，用于相關(guān)生物學(xué)特性的檢測。1.2.2形態(tài)學(xué)檢查每只裸鼠均行詳細(xì)解剖，對肉眼未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的肺臟

10、進(jìn)行連續(xù)切片。短期培養(yǎng)的細(xì)胞生長于蓋玻片上，用950mL/L乙醇固定后，進(jìn)行HE染色觀察。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用30mL/L戊二醛固定、樹脂包埋、超薄切片并染色，以日立JEM?1200電子顯微鏡觀察。1.2.3染色體分析S3細(xì)胞短期培養(yǎng)傳代第3天后，按文獻(xiàn)2所述方法制片，油鏡下隨機挑選100個分散良好且完整的中期分裂象計數(shù)其染色體。消化、Giemsa染色，顯微鏡觀察并拍照。帶型分析采用ISCN(1985)命名。1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞爬片2d，依次用純丙酮室溫固定30min，3mL/LH2O2/甲醇處理30min、水洗，滴加50mL/L小牛血清封閉10min。傾去血清，分別滴加工作濃度為11

11、00的一抗，37孵育1h。PBS振洗，加山羊抗小鼠/兔IgG(1100)，37，30min。PBS振洗，加APA?兔抗山羊IgG，37，20min。PBS振洗、DBA顯色。以蘇木精復(fù)染后，脫水、透明，封片，觀察。實驗中設(shè)陽性對照和以PBS代替一抗的陰性對照。1.2.5體積倍增時間的測定取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/L，接種3塊12孔培養(yǎng)板。每天計數(shù)活細(xì)胞，并繪制生長曲線，計算出體積倍增時間。2結(jié)果2.1各代裸鼠移植的成功率及轉(zhuǎn)移情況術(shù)后23wk左右，可見腫瘤膨脹性生長，各代移植瘤的成功率均為100。病理檢查可見脛骨內(nèi)腫瘤具有骨肉瘤的特征：核深染、核分裂及瘤巨細(xì)胞多見

12、，胞漿嗜酸性,細(xì)胞周圍可見骨樣骨質(zhì)(1)。13代移植瘤肺轉(zhuǎn)移的情況分別為0/6，1/6和5/6。發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺表面可見灰白色半透明結(jié)節(jié)，部分微小轉(zhuǎn)移灶通過連續(xù)切片才可發(fā)現(xiàn)，鏡下見肺轉(zhuǎn)移灶呈結(jié)節(jié)狀或散在分布(2)。2.2形態(tài)結(jié)構(gòu)光鏡下腫瘤細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，呈類上皮樣細(xì)胞形態(tài)，以多邊形、三角形細(xì)胞為主，多核巨細(xì)胞多見；電鏡下高轉(zhuǎn)移亞群細(xì)胞呈幼稚型，分化更低，核形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞器豐富，微絲微管系統(tǒng)發(fā)達(dá)，呈束狀分布。1裸鼠脛骨骨髓腔內(nèi)生長的腫瘤(HE,×40)Fig 1 Growth of osteosarcoma in tibial marrow cavity 2結(jié)節(jié)狀分布的肺轉(zhuǎn)移灶(HE

13、,×100)Fig 2 Nodular distribution of pulmonary metastasis foci 2.3染色體分析高轉(zhuǎn)移亞群腫瘤細(xì)胞的染色體畸變從亞三倍體到超三倍體，數(shù)目變化在5872條之間，眾數(shù)為6568；母系數(shù)目變化在5269條之間，眾數(shù)為6466。鏡下所見微核(間期核)、染色體單體斷裂、雙著絲粒染色體及環(huán)狀染色體畸變低于5。核型分析表明，兩者之間能夠確立的正常染色體和畸變?nèi)旧w基本一致。第8，10，14，18和21號染色體多為2條，有非常類似的一系列標(biāo)記染色體。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，故具體來源未能完全確立(3)。2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色腫瘤細(xì)胞vimentin和a

14、ctin抗原相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物位于胞漿及胞膜上(4)。在高倍鏡下隨機計數(shù)500個細(xì)胞，統(tǒng)計其陽性細(xì)胞數(shù)，未見兩者之間有明顯變化。NSE抗原表達(dá)呈陰性。3轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞S3的核型分析Fig 3 Karyotypic analysis of chromosomes in metastatic osteosarcoma cells S3(× 1000) 4Vimentin陽性物質(zhì)的分布Fig 4 Distribution of Vinmentin? positive substances(APA× 400) 2.5倍增時間兩種細(xì)胞體積的倍增時間分別為(28.3±3.1)h和(27

15、.1±2.8)h，(P0.05)。3討論最新研究表明，人腫瘤細(xì)胞惡性表型的充分表達(dá)，不但需要具備合適的移植環(huán)境，而且還依賴于腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)，以及宿主之間的相互作用，因此，組織塊原位移植是目前公認(rèn)的建立人腫瘤作用模型較為理想的方法1。腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)篩選過程中，由于外界環(huán)境的壓力及其自身遺傳的不穩(wěn)定性，一些腫瘤細(xì)胞可能出現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)和(或)蛋白產(chǎn)物表達(dá)的異常，出現(xiàn)新的異質(zhì)群體，并可逐漸增殖占據(jù)優(yōu)勢3。本文結(jié)果可見，用肺轉(zhuǎn)移灶在裸鼠體內(nèi)原位移植、連續(xù)篩選，不僅可進(jìn)一步提高腫瘤的自發(fā)轉(zhuǎn)移率，篩選出具有高轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞亞群，而且轉(zhuǎn)移細(xì)胞保持了人骨肉瘤的組織學(xué)特征；vimenti

16、n和actin抗原表達(dá)呈陽性，而NSE抗原表達(dá)呈陰性4。同母系相比較，高轉(zhuǎn)移性亞群細(xì)胞體積的倍增時間縮短，肺轉(zhuǎn)移率顯著提高。超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞連接發(fā)育較差，微絲、微管結(jié)構(gòu)豐富，可能有助于其越過基底膜而轉(zhuǎn)移。遺傳學(xué)研究表明，SOSP?M1與其母系之間存在一定的差異。高轉(zhuǎn)移性亞群的染色體數(shù)目分布較分散，較母系多23條。這種差異主要由于腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)經(jīng)多次篩選后，其遺傳學(xué)特性可能發(fā)生改變所致，而這一細(xì)胞遺傳學(xué)特性可能與其高轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)。在染色體結(jié)構(gòu)變化方面，兩種細(xì)胞在G顯帶水平均有一系列復(fù)雜的標(biāo)記染色體，但未能發(fā)現(xiàn)兩者之間的差別。染色體結(jié)構(gòu)的變化及分子細(xì)胞遺傳學(xué)的改變有待進(jìn)一步研究。這

17、兩種遺傳背景相同而轉(zhuǎn)移潛能不同的細(xì)胞，為研究人骨肉瘤轉(zhuǎn)移的機制，特別是篩選腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，提供了非常適當(dāng)?shù)哪Ｐ??；痦椖浚簢易匀豢茖W(xué)基金資助，No.39330200作者簡介：潘朝暉，男，28歲，碩士生西安市霸橋區(qū)新寺路1號 ，Tel.(029)3577733? 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit 潘朝暉（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安710038）范清宇（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安710038）殷劍寧（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜

18、西西安710038）蔣維中（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安710038）張殿中（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所，陜西西安710038）參考文獻(xiàn)：1 Furukawa T, Fu X, Kubob T, et al. Nude mouse metastatic models of human stomach cancer construct using orthotopic implantation of histological intact tissueJ . Cancer Res,1993;53:1204. 2 宋 福 津 ， 馬 紹 武 ， 楊 新 宇 ， 等 .人 骨 肉 瘤 U? 20S的 染 色 體 分 析 J .中 華 醫(yī) 學(xué) 遺 傳 學(xué) 雜 志 ， 1995； 12(2)： 116 117. 3