白藜蘆醇甲基化衍生物對兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液及血清NO和iNOS水平的影響

1、作者：童敏，高戈，高潔生，向大雄【摘要】目的 探討白藜蘆醇甲基化衍生物(BTM)對兔骨關(guān)節(jié)炎（OA）模型關(guān)節(jié)液及血清中NO和iNOS水平的影響。方法 36只健康新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、陽性組和BTM高、中、低劑量組。模型組和陽性組、BTM組用Hulth法復制出實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后8周造模成功。正常組、模型組用生理鹽水2 mL/kg、陽性組用雙醋瑞因4.6 mg/kg、BTM組用BTM高劑量120 mg/kg、中劑量60 mg/kg、低劑量30 mg/kg灌胃，連續(xù)用藥4周后處死兔并切取股骨內(nèi)髁軟骨作光鏡觀察，測定骨關(guān)節(jié)液和血清中NO、iNOS含量。結(jié)果 光鏡下模型組兔關(guān)節(jié)軟骨呈明顯

2、退行性變，BTM組較模型組有顯著修復作用。BTM組關(guān)節(jié)液和血清中NO、iNOS水平顯著低于模型組（P0.05），陽性組和BTM組關(guān)節(jié)液和血清中NO、iNOS水平無顯著性差異（P0.05）。結(jié)論 BTM能夠降低骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)液及血清中的NO和iNOS的水平，抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。 【關(guān)鍵詞】膝骨關(guān)節(jié)炎；白藜蘆醇甲基化衍生物；NO；iNOS；兔 白藜蘆醇（resveratrol，Res，3，5，4，-三羥基-反-均二苯代乙烯）屬非黃酮類多酚化合物，研究證實富含Res的植物多達21個品種，有31個屬72種植物，如葡萄、花生、決明、虎杖等1。文獻2證實白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗自由基、抗癌及

3、改善微循環(huán)等重要作用。骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾患，也是影響老年人生活質(zhì)量最常見的骨關(guān)節(jié)病，是由多種細胞因子和炎性因子參與且以關(guān)節(jié)軟骨破壞為主的病理過程。越來越多的證據(jù)表明，一氧化氮（NO）與OA的發(fā)病機制密切相關(guān)，抑制NO的產(chǎn)生，可以延緩OA的進程。白藜蘆醇的以上藥理作用對骨關(guān)節(jié)炎的病情改善治療具有多靶點、標本兼治的優(yōu)勢。由于白藜蘆醇半衰期短，其在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的研究又極少，所以我們合成了白藜蘆醇甲基化衍生物（BTM），研究其對骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)液及血清中的NO和iNOS水平的影響，探討B(tài)TM對骨關(guān)節(jié)炎的部分作用機制?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。 1

4、 材料與方法 1.1材料 1.1.1動物健康新西蘭兔（中南大學湘雅二院實驗動物室提供）36只，雌雄各半，體質(zhì)量1.52 kg。合格證號：SCXK（湘）2006-0001。 1.1.2藥物白藜蘆醇甲基化衍生物（BTM，中南大學湘雅二院藥劑科自制，純度98.5%，061124）；雙醋瑞因膠囊（陽性藥物，TRB PHARMA S.A.20050515）。根據(jù)成人用藥量與實驗動物用藥的換算公式，計算出每只兔每天用BTM 120 mg/kg，配成濃度60 mg/mL的溶液，每只兔每天用雙醋瑞因4.6 mg/kg，配成濃度4.6 mg/mL的溶液。 1.1.3試劑與儀器NO測定試劑盒（20060630）、

5、NOS測定試劑盒（20061228）南京建成生物工程研究所第一分所；NiKon YS700型顯微鏡；LEICA RM 2135切片機；YT-6C生物組織攤片機；LEICA TP 1020全自動脫水機；722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠制造）（86）量制滬字00000143。 1.2方法 1.2.1動物分組與造模取新西蘭兔36只，隨機分為6組，每組6只。除對照組外，30只兔參照文獻方法3，建立Hulth模型。取兔用3的戊巴比妥鈉按1 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，固定于手術(shù)臺，取右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定。術(shù)后每兔肌注40萬

6、U/kg青霉素，1次/d，注射5 d。兔單籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。 1.2.2給藥方法術(shù)后8周開始按體質(zhì)量灌胃：對照組和模型組給生理鹽水5 mL/d，雙醋瑞因組4.6 mg/（kgd），白藜蘆醇高劑量組120 mg/(kgd)、中劑量組60 mg/(kgd)、低劑量組30 mg/（kgd），灌胃給藥，每天1次，給藥4周。灌胃前后均攝兔膝關(guān)節(jié)X片以備觀察比較。 1.2.3NO、NOS測定給藥4周后取標本：將兔麻醉，造模膝關(guān)節(jié)剪毛，消毒，用1 mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，抽出沖洗液，3 000 r/min離心10 min，取上清液；自兔耳緣靜脈取血10 mL，取血清；用硝酸還原酶法測定關(guān)節(jié)液和血清中N

7、O、NOS含量4，嚴格按試劑盒說明進行操作，在紫外分光光度儀550 nm波長處比色，記錄吸光度。 1.2.4光鏡標本制備兔處死后立即切開膝關(guān)節(jié)，做大體觀察，后以銳利刀片切取股骨內(nèi)髁軟骨，修成1 mm1 mm1 mm的全軟骨層標本置于10%甲醛固定，系列脫水、10% EDTA脫鈣10 d，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，以備光鏡觀察。 1.3統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理。各組數(shù)據(jù)采用()表示，組間差異用雙側(cè)t檢驗。 2 結(jié)果 2.1BTM對骨關(guān)節(jié)炎模型兔膝關(guān)節(jié)X線觀察 正常組膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙均勻一致，股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)面輪廓清晰、光整。模型組膝關(guān)節(jié)脛骨平臺關(guān)節(jié)面不光整，內(nèi)

8、側(cè)間隙明顯變窄，外側(cè)間隙增大，膝關(guān)節(jié)失穩(wěn)。陽性組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄，外側(cè)間隙增大。BTM組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙稍變窄，外側(cè)間隙增大稍寬，與模型組相比股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)面尚光整。 2.2BTM對骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察 正常組膝關(guān)節(jié)軟骨外觀呈藍灰色，色澤明亮，無裂紋及軟化，觸之較硬。模型組關(guān)節(jié)軟骨觸之較軟，尤以股骨內(nèi)髁較明顯，明顯失去原有光澤、發(fā)黃，色澤變暗淡，滑膜存在不同程度增生、粘連，關(guān)節(jié)液量增多，且呈泡沫狀、渾濁，未見明顯骨贅形成。BTM組可見關(guān)節(jié)軟骨外觀呈白色，較光滑，股骨內(nèi)髁觸之變軟，滑膜輕度增生，炎性表現(xiàn)也較模型組輕，BTM組關(guān)節(jié)軟骨狀況明顯優(yōu)于模型組。 2.3兔關(guān)節(jié)液和血清中NO

9、、NOS測定結(jié)果比較 NO、iNOS在骨關(guān)節(jié)液、血清中均有明顯表達，OA動物模型組兔關(guān)節(jié)液、血清中NO、iNOS的水平顯著高于正常組(P0.05），BTM組NO、iNOS水平低于模型組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），高、中、低劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。 2.4關(guān)節(jié)軟骨切片光鏡觀察結(jié)果 (1)正常組：軟骨表面光滑，由淺入深可分為表淺層、移行層、放射層、鈣化層，軟骨細胞排列成柱狀，未見軟骨細胞簇，潮標線完整（圖1）。（2）模型組：表面出現(xiàn)多個空隙窩，軟骨細胞消失，部分軟骨細胞固縮，軟骨表面不光滑，出現(xiàn)多個裂隙，部分軟骨剝脫，形成缺損區(qū)。偏于一側(cè)，關(guān)節(jié)面有壓痕，深層出現(xiàn)軟骨細

10、胞簇積現(xiàn)象，軟骨下骨板增厚（圖1）。（3）陽性組：軟骨表面較光滑，軟骨增生，表面出現(xiàn)部分空隙窩，柱狀排列較明顯（圖1）。（4）BTM組：軟骨表面有表淺裂隙，軟骨細胞柱狀排列較整齊，軟骨數(shù)目多，關(guān)節(jié)面較整齊，潮標線較完整（圖1）。 3 討論 骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾患，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛和不同程度的功能障礙，嚴重時導致功能喪失5?？紤]到OA系多種病因?qū)е碌年P(guān)節(jié)間應力不均且具有關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生這一發(fā)病特點，本實驗采用Hulth造模方法，8周即可成骨性關(guān)節(jié)炎模型6，其具有隨造模時間延長，軟骨退變逐漸加重的特點。本實驗中發(fā)現(xiàn)：術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)普遍出現(xiàn)了骨性肥大，滑液混濁，關(guān)節(jié)邊緣

11、出現(xiàn)大量骨贅，符合OA大體表現(xiàn)，實驗結(jié)果證實了這一方法確能導致骨關(guān)節(jié)炎的形成。Hulth認為此模型所出現(xiàn)的病損與臨床骨性關(guān)節(jié)炎所見的改變?yōu)橥活愋?8周后即出現(xiàn)較明顯的軟骨退變。 軟骨退變磨損、骨質(zhì)硬化、囊變、骨贅、關(guān)節(jié)肥大變形構(gòu)成了骨關(guān)節(jié)炎的病理核心，導致一系列與之相關(guān)的臨床癥狀。本文結(jié)果顯示：從標本可以觀察到模型組兔膝關(guān)節(jié)明顯退變，軟骨表層明顯缺失，關(guān)節(jié)軟骨潰瘍，軟骨細胞紊亂和軟骨細胞丟失，纖維化及少量骨贅形成等，符合骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。藥物組在病理程度上的改變明顯較模型組輕，軟骨表面裂紋少，膠原纖維結(jié)構(gòu)基本完整，固縮的軟骨細胞較少，雖可見部分退變軟骨細胞，但部分軟骨細胞具有較多細胞器，這

12、些都表明軟骨細胞通過增強合成和分泌功能來修復軟骨。 一氧化氮（NO）是OA發(fā)病過程中的重要炎癥介質(zhì)，是一種新發(fā)現(xiàn)的生物信息遞質(zhì)，在軟骨損傷中起重要作用。NO是結(jié)構(gòu)簡單的無機小分子，半衰期很短，越來越多的證據(jù)表明7，NO與OA的發(fā)病機制密切相關(guān)，抑制NO的產(chǎn)生，可以延緩OA的進程。在體內(nèi)，NO是由一氧化氮合成酶(NOS)作用于L-精氨酸產(chǎn)生的。NOS有結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導型(iNOS)之分，其中在關(guān)節(jié)軟骨中起作用的是iNOS。骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中NO的產(chǎn)生主要來源于關(guān)節(jié)軟骨細胞和滑膜細胞，關(guān)節(jié)中增加的炎性因子刺激軟骨細胞和滑膜細胞iNOS的表達，產(chǎn)生NO, iNOS抑制劑能明顯減輕OA軟骨的損傷

13、程度，說明iNOS是NO生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶，對NO的合成及其生物功能的發(fā)揮具有重要意義。大量的NO可進一步促進前炎癥細胞因子釋放，從而抑制軟骨細胞分泌細胞外基質(zhì)和合成型膠原，影響軟骨的營養(yǎng)交換，使其出現(xiàn)惡性循環(huán)、進行性退化。NO也是一種重要的炎癥介質(zhì)，在炎癥反應的許多環(huán)節(jié)發(fā)揮復雜的調(diào)節(jié)作用。白藜蘆醇可降低大鼠氣囊炎中NO含量，因此抑制NO的生成可能是白藜蘆醇抗炎作用機制之一8。本研究結(jié)果表明：NO、iNOS在骨關(guān)節(jié)液、血清中均有明顯表達，OA動物模型組兔關(guān)節(jié)液、血清中NO、iNOS的水平顯著高于正常組。BTM組與陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05），BTM組NO、iNOS水平低于模型組，兩

14、組比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），高、中、低劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明BTM有可能抑制骨關(guān)節(jié)液和血清中NO的合成，使其對軟骨的損害減少并使其它一些因子難以發(fā)揮協(xié)同作用，并明顯延緩軟骨退變進程。因此作者認為BTM能夠降低骨關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)液及血清中的NO和iNOS的水平，抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展，有可能成為改變OA進程的有效藥物。以上所述尚局限于基礎(chǔ)實驗研究階段，真正過渡到臨床還有許多困難和需要解決的問題，值得進一步臨床研究?！緟⒖嘉墨I】1 Kopp P, Resvaratrol, et al. A phytoestrogen found in red wineJ. A possi

15、ble explanation for the conundrum of the French paradoxEur J Endocrinol. 1998，138:619-620.2 Bai Y， Pan JL， Su WW，et al. Research advancement of resveratrol and polytidinJ. Journal of Chinese Medical Materials. 2004，27(1)：55-90. 3 何炳書，劉世清，彭 昊，等.四環(huán)素對兔膝骨關(guān)節(jié)炎的保護作用J.中國老年學雜志，2004，1(24)：37.4 Pandol ST, Periskic S, Gukovsky I, et al. Ethanol diet increases the sensitivity of rats to pancreatitis induced by chotecystokin octapeptidJ. Gastroenterology, 1999,117(3