清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影響的實(shí)驗(yàn)研究                 作者：袁斌  廖輝 汪受傳 徐建亞 李華麗 李江全【摘要】  目的 研究清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞病毒黏附、膜融合過(guò)程的抑制作用。方法 應(yīng)用溫度轉(zhuǎn)換的方法，在病毒黏附階段（溫度轉(zhuǎn)換前）和病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）分別加入清肺口服液含藥血清，監(jiān)測(cè)兩個(gè)階段病毒抑制率和平均吸光度(A)值，觀察研究清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞

2、病毒黏附和膜融合的影響。結(jié)果 溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)前，含藥血清組平均A值與病毒對(duì)照組無(wú)顯著性差異；病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）的清肺口服液含藥血清組病毒抑制率為增多，平均A值明顯升高。溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 清肺口服液含藥血清的抗病毒作用主要表現(xiàn)在呼吸道合胞病毒黏附后的膜融合及侵入階段。 【關(guān)鍵詞】  清肺口服液/血清學(xué)； 呼吸道合胞病毒/中醫(yī)藥療法； 清熱解毒劑； 實(shí)驗(yàn)   【Abstract】  Objective  To study the inhibition effects of Qingfei oral liquid medi

3、cinecontained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Methods  Using the method of temperature conversion，we added Qingfei oral liquid medicinecontained serum during adhesion period(before temperature conversion) and invasion period(after temperature conver

4、sion) respectively.Monitor virus inhibition rates and average A of the two periods，observe the influence of Qingfei oral liquid medicinecontained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Results  No significant differences were found on the average A between

5、 Qingfei oral liquid medicinecontained serum group and virus control group before temperature conversion experiment.After the temperature conversion，virus inhibition rates of Qingfei oral liquid medicinecontained serum group increased，the average A increasing obviously.Differences were significant b

6、efore and after temperature conversion experiment. Conclusion  The antiviral effect of Qingfei oral liquid medicinecontained serum mainly embodies on the membrane fusion and invasion phases  after adhesion process of respiratory syncytial virus.   【Key words】  Qingfei oral l

7、iquid/Serology；  RSV/TCM therapy；  Heatclearing and detoxifying agents;  Expertimental   呼吸道合胞病毒(Respiratory syncyntial virus，RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染最常見(jiàn)的病毒病原1。是老年人和免疫抑制患者呼吸道疾病的重要病原2，西醫(yī)對(duì)其尚無(wú)理想治療措施。清肺口服液(由炙麻黃、苦杏仁、生石膏、黃芩、葶藶子、炙桑白皮、前胡等組成)為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，廣泛應(yīng)用于臨床治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎，療效較好，前期相關(guān)研究也表明，清肺口服

8、液含藥血清對(duì)RSV有抑制作用3，但這種抑制作用的具體環(huán)節(jié)尚未得以闡明。為此，本研究從病毒的微觀組織結(jié)構(gòu)和黏附侵入靶細(xì)胞階段過(guò)程的角度出發(fā)，設(shè)計(jì)進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。    1  材料與方法   1.1  材料  呼吸道合胞病毒A亞型（Long株，廣州博特生物工程有限責(zé)任公司)；Hep2（人喉癌上皮細(xì)胞，布克生物技術(shù)有限公司)；DMEM（美國(guó)GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；0.25%胰酶（美國(guó)GIBCO公司）；MTT（美國(guó)AMRESCO公司）；DMSO(上海永華特種化學(xué)試劑廠)；

9、酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。   1.2  Hep2細(xì)胞  培養(yǎng)Hep2細(xì)胞采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞每23 d傳代，0.25%胰酶消化2 min，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時(shí)停止消化，每次分34瓶。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。   1.3  呼吸道合胞病毒液制備及組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定4  Hep2細(xì)胞以1×108/L接種25 mL培養(yǎng)瓶，每瓶3 mL。將長(zhǎng)成單層細(xì)胞的培

10、養(yǎng)液倒掉，接種病毒液，吸附1.5 h。加入適量含2%小牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)35 d。待細(xì)胞80%產(chǎn)生病變后，置-80 （至少2 h）和37 反復(fù)凍融3次。離心管離心10 min，2 500 r/min。棄沉淀，收集病毒上清液，分裝后于-80 保存?zhèn)溆?。Hep2細(xì)胞以1×108/L接種96孔培養(yǎng)板，每孔100 L。病毒液用維持液10倍系列稀釋8個(gè)濃度。細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液洗細(xì)胞面，接種各稀釋度的病毒液，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中吸附2 h，15 min搖晃1次，使病毒均勻吸附。吸棄病毒液，每孔加維持液100 L，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)

11、培養(yǎng)，逐日觀察病變程度并記錄。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn)，用ReedMuench公式計(jì)算病毒TCID50。   1.4  含藥血清和利巴韋林對(duì)細(xì)胞最大無(wú)毒濃度測(cè)定  Hep2細(xì)胞以1×108/L加入96孔細(xì)胞板，每孔100 L，待長(zhǎng)成單層后，加入維持液稀釋后的清肺口服液含藥血清，每孔100 L，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。置37 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變至72 h。棄去上清液，用移液器每孔加入MTT（1 g/L）100 L。置孵箱孵育4 h。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 100 L，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。選擇4

12、90 nm波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔平均吸光度(A)值，確定藥物的最大無(wú)毒濃度。            1.5  溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)  Hep2細(xì)胞以1×108/L分種于96孔板，100 L/孔，共種2板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合，將板置4 30 min。其中一板吸棄培養(yǎng)液，加入TCID50 RSV，細(xì)胞對(duì)照加冷DMEM，50 L/孔。4 孵育2 h，每隔15 min搖晃1次，使病毒均勻吸附。吸棄病毒液，2%維持液洗2遍。加入2%維持液稀釋的清肺口服液含藥血清（10 g/L），

13、細(xì)胞對(duì)照加DMEM，100 L/孔，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。置35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱孵育1.5 h。吸棄上清，預(yù)熱的2%維持液洗2遍，加2%維持液150 L/孔，35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變并記錄，待病毒對(duì)照出現(xiàn)典型病變時(shí)測(cè)定A值。另一板4 時(shí)將病毒和含藥血清同時(shí)加入，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照。4 吸附2 h。吸棄藥物及其中的病毒，2%維持液洗2遍，加2%維持液150 L/孔。35 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變并記錄，待病毒對(duì)照出現(xiàn)典型病變時(shí)測(cè)定A值。病毒抑制率=（實(shí)驗(yàn)組平均A值-病毒對(duì)照組平均A值）/（細(xì)胞對(duì)照組平均A值-病毒對(duì)照

14、組平均A值）×100%。   1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用±s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。    2  結(jié)果   2.1  含藥血清對(duì)Hep2細(xì)胞最大無(wú)毒濃度  在Hep2中，清肺口服液含藥血清的最大無(wú)毒濃度為10 g/L。   2.2  呼吸道合胞病毒RSVLong株TCID50  在Hep2中，RSVLong株TCID50為10-4.625/50 L。   2.3  溫度轉(zhuǎn)換

15、實(shí)驗(yàn)結(jié)果  溫度轉(zhuǎn)化前病毒抑制率為150%，溫度轉(zhuǎn)化后為1 142%。見(jiàn)表1。表1  3組溫度轉(zhuǎn)換前后平均吸光度值的比較 注：與病毒對(duì)照組比較，aP0.05。   3  討論   RSV屬副黏病毒科肺炎病毒屬，是有包膜的非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA病毒。RSV病毒表面由融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)3個(gè)跨膜蛋白組成，共同參與病毒外膜與宿主細(xì)胞膜胞的融合以及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中合胞體的形成；F蛋白與病毒進(jìn)入細(xì)胞并形成特征性的合胞體有關(guān)，還具有促使RSV在感染細(xì)胞間傳播及溶血的作用5。有研究認(rèn)為F蛋白介導(dǎo)病毒與受染細(xì)胞間

16、的膜融合作用，在病毒感染過(guò)程是必需的6。和其他病毒一樣，呼吸道病毒和宿主細(xì)胞的結(jié)合是病毒進(jìn)入感染靶細(xì)胞的前提條件。多數(shù)病毒在04 低溫下發(fā)生結(jié)合，而僅在接近生理溫度下才侵入細(xì)胞。這是因?yàn)榕c病毒黏附不同，有包膜的病毒的侵入是通過(guò)膜融合完成的，這一過(guò)程需要能量，而所需能量只有在生理溫度下才能得到供給。   本實(shí)驗(yàn)在病毒黏附階段（溫度轉(zhuǎn)換前）加入清肺口服液含藥血清，檢測(cè)平均A值與病毒對(duì)照組無(wú)顯著性差異；在病毒侵入階段（溫度轉(zhuǎn)換后）加入清肺口服液含藥血清，病毒抑制率為1 142%，平均A值明顯升高，靶細(xì)胞受到保護(hù)，提示該藥沒(méi)有直接影響病毒與靶細(xì)胞的黏附，其作用發(fā)揮主要在阻止病毒的膜

17、融合及侵入。提示清肺口服液對(duì)呼吸道合胞病毒的作用位點(diǎn)可能是與此病理過(guò)程緊密相關(guān)的病毒表面F蛋白。清肺口服液可能在感染的早期運(yùn)用療效更好。現(xiàn)代病毒生物分子學(xué)的研究也提示，對(duì)F蛋白結(jié)構(gòu)的深入了解，可以提供研制相關(guān)病毒抑制藥物作用靶位點(diǎn)的線索，進(jìn)而可以阻礙F蛋白構(gòu)象的改變，防止其功能性結(jié)構(gòu)的形成，從而阻斷病毒與細(xì)胞的融合這一環(huán)節(jié)，達(dá)到抑制病毒增殖的目的?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，中醫(yī)藥治療疾病的療效往往通過(guò)多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的共同作用實(shí)現(xiàn)，將從含藥血清對(duì)細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)改變影響的角度進(jìn)一步探討其共同作用機(jī)制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Hall CB.Respiratory syncytial virus：

18、a continuing culprit and conundrumJ.J Pediatr，1999，135(2 Pt 2)：227.2 Falsey AR，Walsh EE.Relationship of serum antibody to risk of respiratory syncytial virus infection in elderly adultsJ.J Infect Dis，1998，177(2)：463466.3 汪受傳，王霖，陳超，等.清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，24（1）：2526.4 傅繼華.病毒學(xué)實(shí)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)M.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2001：6064.5 Kumar M，Behera AK，Lockey RF，et al.Intranasal gene transfer by chitosan2 DNA nanospheres protects BALBPc mice against acute respiratory syncytial virus infectionJ.Hum Gene Ther，2002，13(12