葡聚糖凝膠柱的使用方法

1、葡聚糖凝膠柱的使用方法：(1) 預(yù)處理稱取 Sephadex G-25( 50 100 目)約 5g ，加入蒸餾水 100ml ，置室溫下 3h 進(jìn)行溶脹。(2) 裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為 1:15 。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊， 用洗 凈的玻璃絲(約 200 目尼龍布)墊底或購(gòu)買類似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，先 加入 1/3 柱體積蒸餾水， 接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入， 使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。 同時(shí)大開下口慢速流出蒸餾水。 裝柱后的凝膠必須均勻， 不能有氣泡或明顯條紋。 否則， 必 須到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡 2 3h 即可加樣品分離。(3) 加樣

2、加樣前， 首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出， 直到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊 (或留一極 薄液層)為止。然后，由柱的上端加水解液 2ml ，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完 樣品后， 打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊， 再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容 器 2 3 次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。(4) 洗脫與收集洗脫時(shí)， 用蒸餾水作洗脫劑， 并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行， 使凝膠柱上端保持一定的液層， 防止 凝膠柱表面的液體流干。 本實(shí)驗(yàn)洗脫液流出的速度應(yīng)控制在 0.8 1.0ml/min 。洗脫液的 收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集 3ml ，共收集 10 管。據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 4 或 5

3、號(hào)管核苷酸 濃度最大， 可作為層析鑒定的樣品液。 但因?qū)游鲋L(zhǎng)度的差異， 管號(hào)會(huì)有變化， 必要時(shí)可用 紫外檢測(cè) A260nm ，找出濃度最大的管號(hào)。(5) 凝膠的再生和回收 凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要再生處理。用 0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實(shí)驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95% 乙醇洗兩次，在 60 C烘箱中烘干，回收保存。實(shí)驗(yàn)五 . 葡聚糖凝膠層析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。2學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù) 。【實(shí)驗(yàn)原理】凝膠層

4、析又稱分子排阻層析或凝膠過濾， 是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層 析分離技術(shù)， 這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠( Sepharose)。葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3氯 1， 2環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控 制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被 分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬不

5、等。葡聚糖凝膠層析， 是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱， 各個(gè)組分由于分子量不相同， 在凝膠柱上受到的阻滯作用不同， 而在層析柱中以不同的速度移動(dòng)。 分子量大于允許進(jìn)入凝 膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)完全被凝膠排阻， 不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部， 阻滯作用小， 隨著溶劑在凝膠 顆粒之間流動(dòng)， 因此流程短， 而先流出層析柱； 分子量小的物質(zhì)可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔 內(nèi)，阻滯作用大，流程延長(zhǎng)，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和 完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖凝膠 G 25 作為固定相載體，來分離藍(lán)色葡聚糖2000 和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚

6、糖一2000分子量接近2X 106,而溴酚藍(lán)分子量為 670,二者分子量相差較大，前者 完全排阻，而后者則可完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時(shí)間不同而分開?！緦?shí)驗(yàn)材料】1. 實(shí)驗(yàn)器材層析柱(1疋0cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1);試管及試管架；量筒 10m1； 721 型分光光度計(jì)2. 實(shí)驗(yàn)試劑 Tris 醋酸緩沖液(pH7.0):取 0.0lmol/L Tris 溶液(含 0.1mol/L KCI) 900ml，用濃醋 酸調(diào) pH 至 7.0，加蒸餾水至 1000m1。(2) 溴酚藍(lán)溶液： 稱取溴酚藍(lán) 10 毫克， 溶于 5 毫升乙醇中， 充分?jǐn)?/p>

7、拌使其溶解， 然后逐 滴加入Tris 醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍(lán)色。(3) 藍(lán)色葡聚糖一2000溶液：稱取藍(lán)色葡聚糖一200010毫克，溶于2毫升Tris 醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。(4) 樣品溶液：取溴酚藍(lán)溶液 0.1 毫升，藍(lán)色葡聚糖 2000 溶液 0.5 毫升混勻后為上柱 樣品溶液。(5) 葡聚糖凝膠 G-25 (Sephadex-G-25)【實(shí)驗(yàn)操作】1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)z的制備： 商品凝膠是干燥的顆粒， 使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理， 稱取 4 克葡聚糖凝 膠G 25,加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹 6小時(shí)，或沸水浴溶脹 2小時(shí)，一般 采用后一種方法。 再用傾瀉法除去凝膠上層

8、水及細(xì)小顆粒， 用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次， 再以緩 沖溶液(pH7.0的Tris 醋酸溶液)洗滌2 3次，使pH和離子強(qiáng)度達(dá)到平衡， 最后抽去溶液 及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡,凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。2. 裝柱：將層析柱洗凈,垂直固定在鐵支架上,選擇有薄膜端作為層析柱下口,將下口 接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液,打開下口螺旋夾,讓溶液流出,排除殘留氣泡,最后保留約 2 厘米高度的洗脫液,擰緊螺旋夾。 將凝膠輕輕攪動(dòng)均勻,用玻璃棒沿 層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中,待凝膠沉積到柱床下已超過 l 厘米時(shí),打開下口螺旋夾,繼續(xù)裝 柱至柱床高度達(dá)到 8厘米,關(guān)閉出口。裝柱過程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡,盡可能一次裝完,避

9、免出 現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡 l 至 2 個(gè)柱床體積,凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后, 擰緊下端螺旋夾。3. 加樣品： 打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出, 直至床面與液面剛好平齊為止, 關(guān)閉下 端出口。 取溴酚藍(lán)及藍(lán)色葡聚糖 2000 混合液 0.3 毫升, 小心地加于凝膠表面上, 切勿攪動(dòng) 層析柱床表面。 打開下端出口, 使樣品溶液進(jìn)入凝膠內(nèi), 并開始收集流出液。當(dāng)樣品溶液恰 好流至與凝膠表面平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次， 每次清洗液應(yīng)完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后， 再進(jìn)行下一次洗滌。 最后在凝膠表面上加入洗脫液， 保 持高度為 3 4cm。4. 洗脫與收集：連

10、接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1 毫升，進(jìn)行洗脫。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集 3 毫升即換一支收集管 （ 試管預(yù) 先編號(hào) ），收集約 20 管左右，樣品即可完全被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用 721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 540nm 處測(cè)定其光密度。5. 凝膠回收處理方法： 將樣品完全洗脫下來后， 繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠 后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中， 備用。2 Sephadex LH20 的原理。Sephadex LH20 的分離原理主要有兩方面： 以凝膠過濾作用為主， 兼具反相分配的作

11、用 （在 反相溶劑中）。因?yàn)槟z過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的 化合物保留強(qiáng)， 最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20 對(duì)化合物還起反相分 配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。 如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。看完第 2 點(diǎn)后， 就應(yīng)該清楚 Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類： 反相和正相兩種。 用得 最多的是反相溶劑洗脫， 以甲醇水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用 100 甲醇沖柱。 正相系統(tǒng)以氯仿甲醇最為常見，

12、先用 50氯仿甲醇， 逐漸增加甲 醇比例，最后用 100 甲醇沖柱。4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。 如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇水），樣品用最少體積的甲醇水（盡 可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾喔！要是把 Sephadex LH20 堵啦， 就得將 Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑 洗脫（氯仿甲醇），樣品用最少體積的氯仿甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。5 Sephadex LH-20 的步驟。（1）選擇條件：梯度洗脫在 Sephadex 使用中并不象在正相柱層析中那么重要。 首先你的樣品

13、須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。（2）飽和層析柱：用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降， 此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打 開開關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。（3）樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。（4）濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。（5）洗脫：控制流速，一般 1drop/s 以下，可參見廠家的一些參數(shù) ;必要時(shí)更改極性（很多時(shí) 一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。6 分離的技巧，最后說說我的使用心得（1 ） 流速

14、不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達(dá)。（2）柱子盡可能長(zhǎng)， Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料， 寧可將填料全裝在一根大柱子中， 不要將填料裝成幾根小柱。 所謂集中優(yōu)勢(shì)兵力， 打擊敵人。（3）餾分一定要接的細(xì)，可 110 ，或 120 個(gè)保留體積接成一餾分。（4）洗脫體積一般為 2-3 個(gè)保留體積，對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫 5 個(gè)保留體積。（5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用 Sephadex LH20 分鞣質(zhì)（6）Sephadex LH20 對(duì)黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。（7）填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將

15、柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶 劑將甲醇替換出來，待用。Sephadex LH-20 是由葡聚糖 G-25 羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天 然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等， Pharmadex LH-20 同時(shí)適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備， 既可用于初步純化步 驟，也可用于最終精制步驟，如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分離。1.裝柱 裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄）， 越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于Sephadex LH-20 而言，25100 m的粒徑范圍相 對(duì)于許多用于制備

16、色譜的填料而言， 不能說分布均一， 也就是說其粒徑分布較寬。 然而當(dāng)膠 溶脹后就相對(duì)容易得到均一的柱床。這對(duì)于長(zhǎng)柱（最高至 250cm ）而言也是同樣的。在裝 柱前，層析柱和儲(chǔ)槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。Sephadex LH-20 在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分?jǐn)嚢?，否則 會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。在室溫下， 將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)， 溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑 系統(tǒng)，請(qǐng)參考后頁之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。 使溶脹膠體積沉淀之后占 總體積的 75% ，上層溶劑占 25% ，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠粒可移動(dòng)。 將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)， 在保證膠粒不變形的前提下， 應(yīng)在盡可能高的 壓力下裝柱，反壓不要超過 1.5ba 。2. 平衡上樣前， 用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止， 如