關(guān)于組蛋白高乙酰化介導(dǎo)的Egr-1結(jié)合促進(jìn)gdnf基因高轉(zhuǎn)錄

1、關(guān)于組蛋白高乙酰化介導(dǎo)的 Egr-1結(jié)合促進(jìn)gdnf基因高轉(zhuǎn)錄膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GNDF是一種新型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，屬于 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（TGF-）超家族成員，在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量迅速上調(diào)，至成 年期維持在較低水平。由于 GDN對(duì)多巴胺能神經(jīng)元特異的營(yíng)養(yǎng)作用，一直作為 治療帕金森病的潛在藥物而備受關(guān)注。最近的研究表明，GDN還是膠質(zhì)瘤細(xì)胞強(qiáng)有力的促增殖因子，它在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常膠質(zhì)細(xì)胞，并且能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。目前，有關(guān)GDN對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞促增殖和遷移機(jī)制的研究很多，但是對(duì)于gdnf基因高轉(zhuǎn)錄的發(fā)生機(jī)制卻知之甚少?；虻漠惓８?轉(zhuǎn)錄通常與基因突變以及表觀遺傳學(xué)改

2、變有關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因的異常高轉(zhuǎn)錄與基因突變無(wú)關(guān)，而與該基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白H3K9的高乙?；揎椨嘘P(guān)。諸多的研究已表明，啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的高乙酰化修 飾可以使該區(qū)域染色質(zhì)中的核小體呈排列松散的開(kāi)放狀態(tài)，從而利于轉(zhuǎn)錄因子與之的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游（-186 bp）存在3個(gè)連續(xù)且高度保守的轉(zhuǎn)錄因子 Egr-1的結(jié)合序列， 且Egr-1參與了膠質(zhì)細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和丙咪嗪誘導(dǎo)的gdnf轉(zhuǎn)錄激活。由此我們推測(cè)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白高乙酰化可能以升高 轉(zhuǎn)錄因子Egr-1與之結(jié)合能力的

3、方式引發(fā)該基因的異常高轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證以上假 說(shuō)，我們以大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，利用染色 質(zhì)免疫共沉淀（ChiP）的方法檢測(cè)了以上兩種細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1 結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域H3K9的乙?；揭约癊gr-1與之的結(jié)合能力；通過(guò)組蛋白乙?；?酶（HAT）抑制劑Curcumin和組蛋白去乙?；福℉DAC抑制劑TSA16建立的gdnf 基因啟動(dòng)子II區(qū)乙?；淖兊腃6膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，檢驗(yàn)了 gdnf基因啟動(dòng)子區(qū) Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白乙酰化修飾水平、Egr-1與之的結(jié)合能力以及該基因 轉(zhuǎn)錄水平之間是否存在必然的。1材料和方法主要試劑大鼠C6星形膠質(zhì)瘤

4、細(xì)胞株和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍 存。DMEM/F12培養(yǎng)基胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco，ChIP級(jí)兔源抗乙酰化組蛋白 H3（Lys9）多克隆抗體（貨號(hào)07-352）、EZ-ChIP試劑盒購(gòu)自Millipore ，兔源抗 Egr-1多克隆抗體（貨號(hào)SC-110X）購(gòu)自Santa Cruz，Curcumin、TSA和二甲基亞 砜（DMSO均購(gòu)自 Sigma-Aldrich ，TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen ，Prime ScriptTMII 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自大連 TaKaRa細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理將實(shí)驗(yàn)室凍存的大鼠正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和C

5、6膠質(zhì)瘤細(xì)胞復(fù)蘇于含有10%臺(tái)牛血清（美國(guó)Gibco）的DMEM/F1培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公 司）的培養(yǎng)液中，置于37 C,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q1次液。 取23代生長(zhǎng)良好的大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以1105/ml細(xì)胞濃度接種于六孔板，每孔 2 ml。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匚合度時(shí)，將培養(yǎng)液更改為含有 牛血清白蛋白（美國(guó) Sigma-Aldrich）的無(wú)血清Opti-MEM（美國(guó)Invitrogen），在相同條件下培養(yǎng)24 h。 然后再更換為含有 TrichostatinA（ 終濃度為200 nmol/L）或Cu

6、rcumin（終濃度 為50 mol/L）（均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich）的新鮮無(wú)血清 Opti-MEM 培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)24h，其中對(duì)照組添加等體積的溶劑 DMSOChIP-PCR染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)使用兔抗乙酰化H3K9抗體、兔 抗Egr-1多克隆抗體和正常兔源IgG，按EZ-ChIP chromatinimmu nop reci pi tationkit 說(shuō)明書(shū)的步驟操作。ChI P 實(shí)驗(yàn)后，采用 real-time PCR的方法檢測(cè)目的抗體免疫沉淀下來(lái)的 DNA PCF反應(yīng)體系為：I SYBRPremix Ex TaqTMII;上下游弓I物（F : 5CGAGGAG

7、GTGCAGAGT,GRGGGGGAG-CAAGAGCACGCAA 310 mol/L）各1 l以及DNA模板3加滅菌消毒的雙蒸水補(bǔ)充至總體積 25 I。Real-time PCR引物由康成生用三步法PCF反應(yīng)程序（預(yù)變性：95 C 2 min;PCR反應(yīng)：95 C 15 s，60 C 30 s，72 C 20 s,共40個(gè)循環(huán)）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物大小為283 bp。Real-time PCR 后采用2-Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量，以Input的形式計(jì)算結(jié)果：Input =2（Ct Inpu t-CtChI P）lnput dilution factor100 物（上海）公司合成。Real-t

8、ime PCR 采用 TRIzol（Invitrogen）步法從細(xì)胞中提取總 RNA以1 g總RNA為模板按Prime ScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA第一鏈。利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒在反應(yīng)體系（20 l）下進(jìn)行實(shí) 時(shí)定量 PCR SYBR Premix ExTaqTMII 10 l、上下游引物（10 mol/L）各 I、cDNA 模板1 l和無(wú)核酶水8 I。通過(guò)LightCycler480 熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche）進(jìn) 行實(shí)時(shí)熒光定量分析。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 C預(yù)變性30 s;95 C變性20 s，60 C退火15 s;7

9、2 C延伸15 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。通過(guò)溶解曲線分析 PCFT物 特異性。每個(gè)樣品以gapdh基因的mRN表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2- CT） 法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì) mRNA勺表達(dá)水平。靶基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增的上 下游引物序列見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差 表示。其中，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單 因素方差分析。取表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果超聲斷裂染色質(zhì)后DNA勺電泳結(jié)果大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)超聲破碎染色質(zhì)后各取20 I直接進(jìn)行解交聯(lián)和純化2%瓊脂大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中 gdnf

10、基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1 結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙?；紺hIP-PCR結(jié)果顯示：大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常 星形膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的組蛋白H3K9均發(fā)生了不同程度的乙酰 化修飾。與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1 結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3K9的乙酰化程度極顯著升高（，圖2）。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中 Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子 II區(qū)的結(jié)合情況ChIP-PCR結(jié)果顯示：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄 因子Egr-1都能夠不同程度地與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū) 域結(jié)合。與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比

11、，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子 II區(qū)的結(jié)合量極顯著升高（，圖3）。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)H3K9乙?；揎椊閷?dǎo)的 Egr-1與之的結(jié)合能力調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄我們采用Curcumin和TSA的藥物處理建立了 gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處乙酰化水平改變的 C6膠質(zhì)瘤細(xì) 胞模型，即50 mol/L Curcumin 處理24 h后，顯著降低了 gdnf基因啟動(dòng)子II 區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙?；?；相反的，200 nmol/LTSA處理24 h后， 顯著提高gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙酰化水平（圖4A）。

12、 在此基礎(chǔ)上，采用ChIP-PCR和real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)了 gdnf基因啟動(dòng)子II 區(qū)H3K9乙酰化修飾改變對(duì)Egr-1與之的結(jié)合能力及該基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié) 果顯示，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9低乙?；揎棧瑴p少Egr-1 與之的結(jié)合的同時(shí)，降低了 gdnf mRN的表達(dá)（P而且，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū) Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9高乙?；揎棧诖龠M(jìn)Egr-1與之結(jié)合的同時(shí)，提高了 gdnf mRNA的表達(dá)（，圖 4B, C）。3討論Egr-1是gdnf基因活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。為了探明gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白H3K9高乙?；揎棿龠M(jìn)該基因高

13、轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制，我們利用ChIP-PCR的方法檢測(cè)了大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中該啟動(dòng)子區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3K9的乙酰化狀態(tài)。K9是組蛋白H3調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄激活最 為活躍的乙酰化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1 靶向區(qū)域發(fā)生了組蛋白H3K9的高乙?；揎棧▓D2），與我們之前的研究結(jié)果相 似，表明組蛋白H3K9高乙酰化修飾可能影響到Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū) 的結(jié)合。為了驗(yàn)證以上推測(cè)，我們利用ChIP-PCR的方法檢測(cè)了大鼠C6星形膠質(zhì) 瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中 Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的結(jié)合位點(diǎn)的 結(jié)合情況

14、，發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Egr-1能夠與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的結(jié) 合位點(diǎn)結(jié)合，并且較之正常膠質(zhì)細(xì)胞 Egr-1的結(jié)合量顯著升高（圖3），與我們的 推測(cè)相一致。此外，Shin等人發(fā)現(xiàn)缺失Egr-1結(jié)合位點(diǎn)顯著下調(diào)了 gdnf基因啟 動(dòng)子II區(qū)的啟動(dòng)活性，表明Egr-1的結(jié)合能夠促進(jìn)gdnf基因的轉(zhuǎn)錄活性。由此， 我們提出本文的假說(shuō)，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白高乙?；閷?dǎo)的Egr-1與之 結(jié)合量的升高促進(jìn)了 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中該基因的高轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步證實(shí)以上假 說(shuō)，我們利用以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選了 Curcumin和TSA處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的最佳 作用時(shí)間及作用濃度，并在此基礎(chǔ)上建立了 gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位 點(diǎn)乙?；淖兊腃6膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。發(fā)現(xiàn),Egr-1呈組蛋白H3K9乙?；蕾嚨姆绞浇Y(jié)合到gdnf啟動(dòng)子II區(qū)， 并且促進(jìn)了 gdnf基因的轉(zhuǎn)錄，與我們的預(yù)期相符（圖4）。綜上所述，本研究發(fā) 現(xiàn)了大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組 蛋白H3K9發(fā)生了高乙?；揎棧⑶?/p>