瓜類作物單倍體育種研究進展

1、瓜類作物單倍體育種研究進展李建欣 龐淑敏 方貫娜（鄭州市蔬菜研究所 鄭州 450015）摘要：綜述了瓜類作物單倍體育種的研究進展，包括花藥培養(yǎng)、未授粉子房培養(yǎng)和輻射花粉誘導單倍體培養(yǎng)在瓜類作物育種中的應(yīng)用；總結(jié)了近年來所采用的瓜類作物染色體倍性鑒定方法和加倍技術(shù)；討論了目前這些領(lǐng)域存在的問題和今后研究的方向。關(guān)鍵詞：瓜類；單倍體；誘導；育種Research advances of haploid breeding of cucurbit cropsLi Jian-xin,Pang Shu-min,Fang Guan-na(Zhengzhou Vegetable Research Institu

2、te,Zhengzhou,450015,China)Abstract: Research advances of haploid breeding of cucurbit crops were reviewed in the paper,including anther culture,ovary culture and induction of haploid obtained by irradiated pollen.Progress of method of ploidy determination and technique of chromosome doubling in cucu

3、rbit crops were summarized.Problems and new points to be probed in these areas were proposed.Key Words:cucurbit crop;haploid;induction;breeding隨著植物組織、器官和細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷深入與發(fā)展，單倍體材料以其獨特的優(yōu)勢在作物育種中得到了廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。在瓜類作物中，自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低1，為了獲得單倍體，研究者嘗試了花藥培養(yǎng)、未授粉子房離體培養(yǎng)，輻射花粉誘導的孤雌生殖等手段誘導單倍體。目前據(jù)報道南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬和苦瓜屬等5個屬中均已獲得了單倍

4、體，有的已開始在育種中加以利用2。1 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)是以花藥為外植體，在單核期誘導小孢子分裂形成胚狀體或胚性愈傷組織，然后誘導芽并進一步產(chǎn)生單倍體植株。Dryanovska和Ilieva3從甜瓜花藥培養(yǎng)產(chǎn)生了單倍體植株；在國內(nèi)，薛光榮和陶正南4,5分別報道了成功獲得西瓜和甜瓜花粉植株的研究。但由于誘導率低，未能有效用于西瓜和甜瓜的育種中。總的來講，瓜類作物通過花藥培養(yǎng)誘導單倍體難度較大，只有西瓜的花藥培養(yǎng)較為成功。Xue等6于1981年利用瓊酥西瓜品種，通過培養(yǎng)單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中選育出了優(yōu)良新品種。袁萬良等7通過研究解決了愈傷組織褐變死亡的問題

5、，將分化階段愈傷組織的誘導率從0.5提高到94.4。魏英8在4和10的低溫條件下進行預處理，降低了花藥壁愈傷組織的形成，提高了花藥愈傷組織的誘導率。在南瓜花藥培養(yǎng)上，直到1998年，Metwally等9才成功得到了10棵單倍體植株，并對培養(yǎng)基進行了篩選，發(fā)現(xiàn)單核中期和單核晚期的南瓜小孢子接種在MS15的蔗糖5 mg·L-1 2,4-D上培養(yǎng)效果較好，每塊愈傷組織植株再生頻率可達19.2。在甜瓜的花藥培養(yǎng)上，Dryanovska等3曾做過嘗試，結(jié)果以失敗告終。最早報道黃瓜花藥培養(yǎng)的是日本的西貞夫，他指出黃瓜花藥愈傷組織形成率對生長素的反應(yīng)是敏銳的，其增殖也遠比其他蔬菜迅速，但將其白中微

6、帶黃色的愈傷組織移植到分化培養(yǎng)基上僅見畸形莖葉的分化，卻最終不能育成成體植株10。Lazarte等11(1982)對黃瓜花藥進行培養(yǎng)表明，深綠色的愈傷組織常常分化為胚狀體及分生組織，胚狀體可進一步發(fā)育為幼苗。Ashok等12(2003)通過花藥培養(yǎng)方法獲得了單倍體植株，探討了預處理、生長因子對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，認為4預處理2d的黃瓜花藥愈傷組織誘導率及胚胎誘導率最高。通過對生長因子的研究結(jié)果表明，生長素中2,4-D比其它生長素效果更佳，最佳濃度為2.0M；細胞分裂素BA優(yōu)于KN、TDZ，且誘導培養(yǎng)基中低濃度的細胞分裂素有利于啟動雄核發(fā)育；同時ABA可促進子葉型胚的正常生長并發(fā)育成完整植株，對

7、細胞胚性的保持具有較好的作用。此外黃瓜花藥可以通過直接胚狀體和愈傷組織途徑獲得單倍體植株12，且花藥培養(yǎng)受基因型的影響。Kunmar等13(2004)對黃瓜花藥培養(yǎng)的碳源及氨基酸的研究表明花藥誘導培養(yǎng)的最佳碳源為蔗糖，濃度0.25M；混合氨基酸 (谷胱氨酸，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸) 在一定濃度范圍內(nèi)的效果比單一氨基酸的效果更好，這說明黃瓜花藥培養(yǎng)需要較為充足的營養(yǎng)環(huán)境。2 子房培養(yǎng)瓜類作物通過花藥培養(yǎng)途徑誘導單倍體較困難，鑒于大孢子也是單倍性的，研究者又嘗試用雌核發(fā)育途徑來誘導單倍體，并取得了一定的成功。雌核發(fā)育主要包括離體條件下的雌核發(fā)育和活體條件下的雌核發(fā)育兩個方面。在瓜類作物

8、中，主要通過未授粉子房和輻射花粉授粉后的子房進行離體培養(yǎng)兩種途徑。2.1未授粉子房離體培養(yǎng)通過未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)誘導單倍體在黃瓜、甜瓜、南瓜屬上均已見成功的報道。Gémesné等14對黃瓜未授粉子房培養(yǎng)的條件進行過很多探索。1997年，他們?nèi)?.51.0 cm長的黃瓜子房通過離體培養(yǎng)首次在黃瓜上獲得的了單倍體植株，由于誘導條件和取材大小的原因，誘導頻率很低。2002年，他們15對6種不同基因型的黃瓜進行了取材時期和預處理方式的研究，發(fā)現(xiàn)雌花開放前6 h時胚囊剛好形成，胚的誘導頻率最高，同時發(fā)現(xiàn)熱處理可以提高最適發(fā)育階段雌配子的雌核發(fā)育頻率。他們采用的黃瓜胚狀體誘導培養(yǎng)

9、基為CBM附加不同濃度的TDZ（0.02-0.10 mg·L-1），適宜的蔗糖濃度為40 g·L-1。杜勝利等16,17研究了黃瓜離體雌核發(fā)育時的解剖特征和培養(yǎng)早期外植體的生理生化變化，結(jié)果表明，在子房培養(yǎng)的前6 d，外植體的各種酶都發(fā)生了與對照明顯不同的變化，解剖學觀察發(fā)現(xiàn)此時雌核發(fā)育既已開始。培養(yǎng)24 d 胚狀體開始形成，40 d形成成熟的胚狀體。在南瓜屬中， Metwall等18和陳學軍等19利用未授粉胚珠培養(yǎng)，Gémesné等14利用未授粉子房培養(yǎng)均成功的獲得了單倍體植株。同時Metwall等18對4低溫預處理效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)植株再生頻率在未

10、經(jīng)過低溫處理時最好。甜瓜子房培養(yǎng)的報道相對較少。Gémesné等14曾對培養(yǎng)條件進行過摸索，并得到了單倍體植株。Ficcadenti等20采用了與Gémesné等14相似的培養(yǎng)方法獲得了甜瓜的單倍體植株，最高胚發(fā)生頻率可達36.4，再生植株中單倍體發(fā)生頻率為15.4。2.2 輻射花粉授粉誘導單倍體研究Sauton等21通過輻射花粉授粉結(jié)合胚胎拯救技術(shù)從甜瓜作物中成功地獲得了單倍體植株，隨后人們對基因型、輻射劑量等影響因素進行了系統(tǒng)的研究并將其應(yīng)用于其他瓜類作物，取得了很大成功。2.2.1 培養(yǎng)基在黃瓜和甜瓜作物單倍體育種中的胚拯救技術(shù)一般將輻射花粉授粉后

11、23周的果實剖開，把種子接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，約10 d后將肉眼可見的綠胚種子挑出，剝出綠胚接種在MS+6-BA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基上生長22,23。在以上培養(yǎng)基上雷春22等的研究報道黃瓜單倍體產(chǎn)率最高可達2.7，而張永兵23等研究報道的厚皮甜瓜4810和薄皮甜瓜新富玉單倍體植株的誘導頻率分別為055和063。謝淼24等胚拯救的誘導培養(yǎng)基采用E20A+IAA 0.01 mg·L-1，芽伸長培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.05 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg·L-1+1.0 g·L-1活性炭

12、，其單倍體再生率最高為128。2.2.2 基因型的影響 基因型對單倍體產(chǎn)生的影響因作物不同有些差異。Ficcadenti等25對甜瓜進行研究發(fā)現(xiàn)，不同的正反交組合對單倍體的誘導有顯著影響。Faris等26。 用8種不同基因型的黃瓜進行試驗也證明，同一劑量下的單倍體發(fā)生頻率同基因型無關(guān)。2.2.3 輻射劑量對單倍體誘導的影響Co60產(chǎn)生的 射線是輻射花粉授粉技術(shù)誘導瓜類作物單倍體的有效輻射源。輻射劑量的選擇是誘導單倍體的關(guān)鍵因素之一。實踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量的標準。輻射劑量與作物的種類、輻射的器官和植株的生長狀態(tài)等有關(guān)。黃瓜選用的劑量以200300 Gy輻射時單倍體的誘導率較

13、高27。西瓜的常用劑量也為200300Gy24,25；甜瓜的輻射劑量較常用的是5002500 Gy21；南瓜的有效輻射劑量普遍較低，通常為255O Gy。2.2.4 其他因素的影響親本植株良好的生長狀態(tài)直接影響到單倍體的發(fā)生頻率，因此植株生長在適宜的溫濕環(huán)境很重要?；ǚ酃艿竭_胚囊的數(shù)量越多，越能有效地促進雌核發(fā)育21，從而提高單倍體的誘導率，因此輻射授粉前后花粉活力的保持和授粉量的多少也是影響誘導率的關(guān)鍵因素。此外，輻射花粉誘導雌核發(fā)生產(chǎn)生的胚大都不能發(fā)育完全，敗育胚的比例很高，可能與發(fā)育不全的胚乳營養(yǎng)供應(yīng)不足有關(guān) ，因此適時進行胚拯救也非常重要。3 瓜類作物單倍體植株加倍技術(shù)研究在瓜類作物單

14、倍體育種中的單倍體自然加倍率很低，僅在西瓜上有過報道6，人為加倍技術(shù)一般借鑒傳統(tǒng)的西瓜、甜瓜整體誘導多倍體的方法秋水仙堿浸泡法來處理單倍體植株，并無多大改進，因此存在誘導頻率低、誘變植株發(fā)育不良、花期延遲、部分植株為嵌和體等缺點，離實際應(yīng)用還有一定的距離。目前，關(guān)于瓜類單倍體加倍的深入研究較少，并且僅局限在單倍體植株的離體加倍處理。K.Abak等29，對黃瓜單倍體植株進行離體加倍試驗，具體作法是：取一個月左右的無菌苗在無菌狀態(tài)下用秋水仙堿浸泡后，用無菌水沖凈，轉(zhuǎn)入E20A培養(yǎng)基培養(yǎng)，被馴化后的小苗轉(zhuǎn)入蛭石中育苗，結(jié)果以0.5秋水仙堿處理4h或1秋水仙堿處理2h兩個處理對黃瓜單倍體加倍均有效，但

15、誘導成活率較低，僅為6左右。N.Sari和K.Abak等30，采用0.5秋水仙堿和以上方法也成功地使西瓜單倍體加倍得到雙單倍體植株，而用1秋水仙堿浸泡西瓜單倍體幼苗生長點24h，卻未獲得雙單倍體植株。因此他們認為，與甜瓜相比，西瓜對秋水仙堿的敏感程度較低。在加倍得到的西瓜雙單倍體植株有正常的葉片大小、生長勢和育性，自交能獲得種子。4 單倍體植株的倍性鑒定4.1 染色體記數(shù)法 染色體計數(shù)法,是確定倍性最基本和最精確的方法,通常以根尖為材料,也可選擇以卷須、葉片愈傷組織為材料,常采用壓片法和去壁低滲法進行染色體標本制備,其中后者是當前植物染色體研究中的重要方法,該方法既可用于染色體計數(shù),還可用于染

16、色體組型分析Gimsa分帶等研究,并可借助掃描電鏡對植物染色體進行觀察。4.2 形態(tài)鑒定法N.Sari等30研究比較了兩個西瓜品種二倍體及其單倍體植株的田間表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)單倍體植株的葉面積、莖長、莖粗顯著低于二倍體，單倍體植株的雌、雄花也明顯小于二倍體，單倍體雄花中沒有花粉粒，而二倍體則有。韓毅科、杜勝利等31在進行黃瓜單倍體鑒定時發(fā)現(xiàn)黃瓜單倍體一般葉片較小，植株長勢較弱，單倍體不能正常結(jié)子，雄花敗育，其中單倍體雌雄花花冠明顯深裂，可作為區(qū)分黃瓜單倍體和二倍體植株的明顯形態(tài)標志。4.3 細胞學鑒定法若進行單倍體誘導、加倍研究，根據(jù)植株形態(tài)鑒定其倍性，時間較晚，因此必須借助細胞學手段進行培養(yǎng)期的倍性

17、鑒定。目前，染色體計數(shù)法是倍性鑒定最準確、直接的鑒定方法，但染色體制片需要較高的細胞學水平，且費時、費力。N.Sari等30在西瓜上、Norio Katon等32馬國斌等33在甜瓜上發(fā)現(xiàn)葉片保衛(wèi)細胞葉綠體個數(shù)與植株倍性呈正相關(guān)，可作為鑒定西、甜瓜植株倍性的快速、有效的方法，而在黃瓜上也存在這種相關(guān)性。N.Sari等30、張興平等34在西瓜上利用流式細胞儀（flow cytometry）測定細胞核內(nèi)DNA的含量，可迅速確定細胞的倍性并進一步鑒定植株的倍性。5 存在問題及展望目前瓜類作物單倍體育種中的子房培養(yǎng)、胚搶救和花藥培養(yǎng)等均已獲得成功，并取得了可喜的進展，但仍然存在誘導頻率低31，重復性差等

18、問題，因此離建立一套成熟的培養(yǎng)體系還有一定距離。瓜類作物的單倍體培養(yǎng)自然加倍率不高，這些植株必須經(jīng)過秋水仙堿等處理后才能變?yōu)槎扼w，有的甚至會產(chǎn)生多倍體，這些都不在研究者的控制范圍之內(nèi)，因此單倍體加倍方法有待繼續(xù)探討。單倍體育種中是否出現(xiàn)理想的重組體是關(guān)鍵，后代株系間的分離類型、出現(xiàn)頻率、變異幅度是育種者關(guān)心的問題，現(xiàn)在還沒有人對瓜類單倍體培養(yǎng)的后代變異進行研究。自交系選育是現(xiàn)代雜交優(yōu)勢育種的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的 F1經(jīng)多代自交、回交一般需要5-6年或更長時間才能純合，而用單倍體誘導及加倍技術(shù)僅需 5-6 個月，便可從優(yōu)良品種 F1 中獲得優(yōu)良純系，加速自交系的選育，獲得新的育種材料，縮短育種年限，從

19、而提高瓜類作物新品種的選育速度。此外，離體培養(yǎng)直接得到純合株，有利和不利的隱性突變基因都可以得到表達，進行離體誘變和抗性突變體篩選，可使選擇效率大大提高?？傊?，隨著瓜類單倍體技術(shù)的深入研究和應(yīng)用，對其在育種材料的創(chuàng)新、新品種的培育，將發(fā)揮更重要的作用，促進瓜類生產(chǎn)的發(fā)展。參考文獻1 Savin F ，Decomble V ，Le Couviour M ，et .al. The X-ray dtection of haploid embryos arisen in muskmelon Cucumis melo L.seeds，and resulting from a parthenogeneti

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