實(shí)驗(yàn)性脾氣虛大鼠血清胃泌素、胃竇G細(xì)胞的變化及黃芪建中湯的干預(yù)

1、實(shí)驗(yàn)性脾氣虛大鼠血清胃泌素、胃竇G細(xì)胞的變化及黃芪建中湯的干預(yù)                   作者：鄭小偉 包素珍 王穎 宋紅【摘要】  目的探討脾氣虛證大鼠血清胃泌素（gastrin，GAS）、胃竇黏膜胃泌素分泌細(xì)胞（G）的變化及黃芪建中湯的干預(yù)作用。方法以三因素復(fù)合的方法復(fù)制脾氣虛證大鼠模型，隨后分別以黃芪建中湯低、中、高劑量對(duì)脾氣虛大鼠進(jìn)行復(fù)健，在干預(yù)后不同時(shí)間段，分別檢測血清木糖濃度、血清肌酸磷酸激酶活性、血清G

2、AS水平及胃竇G細(xì)胞等指標(biāo)。結(jié)果隨用藥時(shí)間的延長，各用藥組上述指標(biāo)逐步恢復(fù)；中、高劑量組用藥21天時(shí)，與同期模型組比較，差異有顯著性（P0.05或P0.01）；其中，高劑量組對(duì)G細(xì)胞數(shù)的改善作用，優(yōu)于中劑量組（P0.05）。結(jié)論脾氣虛證胃竇G細(xì)胞數(shù)量減少，釋放GAS減少，血清GAS水平降低；黃芪建中湯對(duì)脾氣虛大鼠有可靠的治療作用，中、高劑量均為有效用藥濃度，尤以高劑量更為理想。 【關(guān)鍵詞】  脾氣虛證；大鼠；胃竇；胃泌素；G細(xì)胞；黃芪建中湯有關(guān)脾虛證與胃泌素的關(guān)系是近年來研究的熱點(diǎn)，比較一致的看法是胃泌素與脾虛證關(guān)系密切。但是，在此研究方面，國內(nèi)外大多局限于血清放免方面的研究，且結(jié)論

3、各家報(bào)道不一。本研究以三因素復(fù)合（大黃法、游泳力竭法、饑餓法）的方法制作脾氣虛證大鼠模型，對(duì)其血清胃泌素（gastrin，GAS）及胃竇黏膜胃泌素分泌細(xì)胞（G細(xì)胞）進(jìn)行比較研究，從神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的角度，來探討脾氣虛證與胃泌素及其分泌細(xì)胞的關(guān)系。此外，研究設(shè)計(jì)選用經(jīng)方黃芪建中湯為工具藥對(duì)脾氣虛證動(dòng)物模型進(jìn)行復(fù)健，在驗(yàn)證模型成功的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討經(jīng)方治療該證的可能機(jī)制，為進(jìn)一步臨床使用提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  動(dòng)物及分組  清潔級(jí)Wistar大鼠136只，雌雄各半，體重（180±20）g，鼠齡8周，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

4、提供。實(shí)驗(yàn)前先飼養(yǎng)觀察3天。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組（32只），模型組（32只），黃芪建中湯低、中、高劑量組（各24只）。1.2  藥物制備  中藥均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部。大黃制劑：將生大黃飲片碎成粉，用蒸餾水浸泡，置于50水溶6h，去渣取汁；黃芪建中湯藥物組成：黃芪9g，白芍18g，桂枝9g，炙甘草6g，生姜9g，大棗12g，飴糖30g。按國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炮制后，提取加工成水煎劑，低、中、高劑量濃度分別為含生藥1.5kg/L、3kg/L、6kg/L。1.3  試劑及儀器  D木糖試劑盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所

5、；兔抗大鼠胃泌素抗體，北京北方生物技術(shù)研究所；酶標(biāo)記HRP二抗，美國DAKO公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB），北京中山生物技術(shù)公司；DK600S型三用恒溫水浴箱；PYXDHS35×40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；SN695型智能放免測量儀；LX20型Beckman全自動(dòng)生化分析儀；722型光柵分光光度計(jì)；1512型Leitz型組織切片機(jī)；OLYMPUS雙目顯微鏡；LEICADMLB偏光攝像顯微鏡等。1.4  方法  模型組，黃芪建中湯低、中、高劑量組，以三因素復(fù)合法復(fù)制脾氣虛證模型，具體方法每日上午以3ml/只灌服大黃制劑液，日1次；每日下午將動(dòng)物負(fù)重于大鼠尾根部纏繞重量為

6、該大鼠體重10%的保險(xiǎn)絲，放入水深50cm、水溫20的水槽中游泳，以力竭為度大鼠鼻尖沒入水面10秒，日1次?？刂骑嬍常咳?：00am給食，8：00pm撤食。共21天。造模期間正常組每日上午以3ml/只灌服生理鹽水，自由飲食。共21天。實(shí)驗(yàn)第22天，從正常組和模型組各隨機(jī)取出8只大鼠，摘眼球取血，作相關(guān)處理后處死。其余大鼠繼續(xù)實(shí)驗(yàn)：正常組、模型組給予生理鹽水灌胃3ml/d，用藥組分別給予黃芪建中湯低、中、高劑量3ml/d灌胃，共21天。分別于干預(yù)后第7、14、21天每組各取大鼠8只，分3次處理。1.5  癥狀、體征觀察  實(shí)驗(yàn)全程觀測動(dòng)物的體重，食量，糞便（腹瀉、肛門污穢、

7、拉尾排便），毛色，拱背，嗜睡倦怠，扎堆，乏力等情況。比較各組之間癥狀與體征的區(qū)別。1.6  指標(biāo)檢測  全部大鼠眼球取血，分離血清，檢測血清木糖濃度、血清肌酸磷酸激酶（CPK）活性、血清GAS。動(dòng)物解剖后，取胃竇部組織，以EnVision二步法檢測胃竇G細(xì)胞。G細(xì)胞計(jì)數(shù)：光鏡下G細(xì)胞顯棕黃色，呈帶狀分布于黏膜中下帶，胞漿內(nèi)有深淺不同的棕黃色或棕褐色顆粒。光鏡高倍視野（×400）對(duì)每張切片取胃竇部5個(gè)視野，讀G陽性細(xì)胞數(shù)，并換算出每mm2面積內(nèi)G細(xì)胞數(shù)。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0處理數(shù)據(jù)，數(shù)值用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（

8、x±s）”。2  結(jié)果2.1  脾氣虛證造模情況  造模大鼠于第2、3天開始泄瀉，多為便溏；第6、7天，出現(xiàn)食量減少；10天以后，出現(xiàn)成群蜷縮，扎堆，拱背，精神倦怠，嗜臥，四肢無力，反應(yīng)遲鈍，拉尾排便次數(shù)增多，同時(shí)毛發(fā)枯槁，甚至稀少；到18、19天，多數(shù)動(dòng)物肛門脫垂，明顯消瘦；正常組大鼠飲食、活動(dòng)、大便性狀及毛發(fā)等均無異常，體重逐漸增加。動(dòng)物解剖后，造模組大鼠胃黏膜顏色變淺，表面黏液少，可見黏膜水腫或糜爛，點(diǎn)狀出血，個(gè)別出現(xiàn)大小不一的潰瘍面；正常組大鼠胃黏膜表面平整光滑，呈粉紅色，有光澤，被覆較多黏液，黏膜皺襞規(guī)整，胃壁彈性良好。HE染色，經(jīng)光鏡觀察，造

9、模組大鼠胃黏膜薄、黏膜表面輕度糜爛，上皮壞死、脫落而不完整，固有層及黏膜下層炎細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞數(shù)量明顯增加，血管擴(kuò)張充血；正常組胃黏膜結(jié)構(gòu)清楚，上皮完整，可見絨毛和皺襞，炎細(xì)胞浸潤較少，腺體完整且排列整齊。指標(biāo)檢測顯示：模型組大鼠的血清木糖濃度、CPK活性、血清GAS及胃竇黏膜G細(xì)胞數(shù)下降，與正常組比較，差異有顯著性（P0.01）。結(jié)果見表1，表明脾氣虛證模型成立。         表1  三因素復(fù)合法對(duì)大鼠的影響（略）與正常對(duì)照組比較，*P0.012.2  黃芪建中湯對(duì)血清木糖濃度、CPK活性

10、影響的劑量與時(shí)間效應(yīng)  見表2。黃芪建中湯各劑量組血清木糖濃度、CPK活性隨著用藥時(shí)間的延長呈遞增的趨勢。其中，高劑量組用藥14天時(shí)，血清木糖濃度與同期模型組比較，差異有顯著性（P0.5）；中、高劑量組用藥21天時(shí)，血清木糖濃度、CPK活性與同期模型組比較，差異均有顯著性（P0.5或P0.1）。表2  各組大鼠血清木糖濃度、CPK活性比較（略）與同期模型組比較，*P0.05，*P0.012.3  黃芪建中湯對(duì)血清GAS影響的劑量與時(shí)間效應(yīng)  見表3。黃芪建中湯各劑量組血清GAS隨著用藥時(shí)間的延長呈遞增的趨勢。其中，高劑量組用藥14天時(shí)，與同期模型組比較，

11、差異有顯著性（P0.5）；而中、高劑量組在用藥21天時(shí)，與同期模型組比較，差異均有顯著性（P0.1）。表3  各組大鼠血清GAS、G細(xì)胞數(shù)比較（略）與同期模型組比較，*P0.05，*P0.01；與同期高劑量組比較，P0.052.4  G細(xì)胞的分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)  免疫組化染色G細(xì)胞為深棕色，主要分布于胃竇黏膜腺體的中下1/3，或散布于黏膜上皮細(xì)胞之間，細(xì)胞分布不均勻，常單個(gè)或幾個(gè)夾在腺細(xì)胞之間，對(duì)照片為陰性。細(xì)胞形態(tài)各異，呈圓形、柱狀、棱形或不規(guī)則，有的連續(xù)在一起形成團(tuán)狀。胞質(zhì)內(nèi)分泌免疫反應(yīng)顆粒粗大，著色較深，為或棕黃色或淡棕色或棕褐色顆粒，有的細(xì)胞有突起，伸入到

12、其它腺細(xì)胞之間，或基膜之間，或到腺腔。造模大鼠胃黏膜組織受損，胃竇G細(xì)胞胞漿內(nèi)分泌免疫反應(yīng)顆粒細(xì)小，著色變淺，數(shù)量減少，甚至缺如。2.5  黃芪建中湯對(duì)胃竇黏膜G細(xì)胞數(shù)影響的劑量與時(shí)間效應(yīng)  黃芪建中湯各劑量組胃竇黏膜G細(xì)胞數(shù)隨著用藥時(shí)間的延長呈遞增的趨勢。其中，中、高劑量組用藥21天時(shí)，與同期模型組比較，差異均有顯著性（P0.5或P0.1）；且中劑量組與高劑量組相互比較，差異亦呈顯著性（P0.05），以高劑量組為優(yōu)。見表3。3  討論3.1  脾氣虛證造模方法  復(fù)雜的病因是中醫(yī)臨床癥候的一大特點(diǎn)，本研究采用大黃法、游泳力竭法和饑餓法復(fù)合，模

13、擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因來復(fù)制脾氣虛證模型，是在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下從本質(zhì)上對(duì)證候進(jìn)行復(fù)制，并充分體現(xiàn)了中醫(yī)致病因素的多重性。造模后，大鼠相繼出現(xiàn)消瘦、大便溏泄、倦怠乏力、毛發(fā)不榮等脾氣虛證的癥狀與體征；同時(shí)，造模大鼠血清木糖濃度、CPK等較為公認(rèn)的客觀指標(biāo)均有明顯改變。在造模因素撤去后，模型大鼠以上癥狀、體征仍存在，各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯改善，而用藥組則得到了不同程度的恢復(fù)。說明多因素復(fù)合復(fù)制的脾氣虛證大鼠模型穩(wěn)定性良好，克服了單因素造模方法持續(xù)時(shí)間短、自愈性強(qiáng)的缺點(diǎn)。該方法在思路和方法上符合中醫(yī)基本理論，復(fù)制的動(dòng)物模型出現(xiàn)相應(yīng)證的證候，并經(jīng)得起藥物反證，符合脾虛動(dòng)物模型造型的基本要求，是切實(shí)可行、穩(wěn)定的脾氣虛

14、證造模方法。3.2  脾氣虛模型GAS、G細(xì)胞的變化  本研究建立的脾氣虛證大鼠模型胃黏膜組織受損，胃竇黏膜G細(xì)胞數(shù)量減少，甚至缺如，著色變淺，說明該造模方法復(fù)制的脾氣虛大鼠的胃腸黏膜組織已發(fā)生器質(zhì)性改變。由于G細(xì)胞數(shù)量降低、細(xì)胞內(nèi)含有的胃泌素分泌顆粒減少，導(dǎo)致GAS分泌量下降，從而使血清GAS水平下降。另外，由于GAS的分泌還受胃腸內(nèi)容物刺激的影響，脾氣虛弱，消化吸收功能障礙，食欲減退，胃內(nèi)容物減少，經(jīng)過消化的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物也相應(yīng)減少，這樣亦會(huì)使GAS的分泌量降低，從而影響胃酸和蛋白酶的分泌，反過來進(jìn)一步加重消化機(jī)能障礙，構(gòu)成逐漸加重的惡性循環(huán)?？梢酝普摚浩馓撟C胃竇黏膜G細(xì)胞數(shù)量減少，胞漿內(nèi)分泌免疫反應(yīng)顆粒細(xì)小，著色變淺，釋放GAS減少，血清GAS水平降低。3.3  黃芪建中湯對(duì)脾氣虛大鼠的干預(yù)作用  黃芪建中湯對(duì)脾氣虛證大鼠有可靠的治療作用。隨著用藥時(shí)間的延長，各劑量組的相關(guān)指標(biāo)逐漸改善。用藥14天時(shí)：高劑量組由于濃度高，在體內(nèi)達(dá)到有效血藥濃度的時(shí)間相對(duì)較快，使部分指標(biāo)血清木糖濃度和血清GAS已經(jīng)得到恢復(fù)；用藥21天時(shí)：由于用藥時(shí)間長，