紫外線誘發(fā)DNA的損傷及維生素C對DNA的保護(hù)作用

1、科研訓(xùn)練題目：紫外線誘發(fā)DNA的損傷及維生素C對DNA的保護(hù)作用摘要: 大氣臭氧層的破壞導(dǎo)致到達(dá)地面的紫外線(UV)明顯增加，長期過量的紫外線照射(UVR)可引發(fā)多種疾病，尤其表現(xiàn)在皮膚紫外線損傷和皮膚癌的發(fā)病率不斷增加. 維生素c是人體血漿及組織中的一種主要的水溶性抗氧化劑,我們用拉曼光譜探討維生素C對紫外線誘發(fā)DNA損傷的保護(hù)作用。別椅測了DNA與不同濃度維生素c的混合物經(jīng)10和30 min紫外輻射的拉曼光譜，低于035的維生索c對紫外線誘發(fā)的E懶損傷具有明顯的保護(hù)作用，且保護(hù)效果隨著其濃度的增大越來越好，當(dāng)維牛素c的濃度高于035時(shí)，在10min的紫外輻射中，維生素c不僅沒有保護(hù)DNA，

2、反而促進(jìn)了DNA的損傷，DNA被損傷的程度隨著維生素c濃度的增加而增加。 關(guān)鍵詞：維生素C 紫外線 DNA損傷人類對自然環(huán)境破壞的日益加重，使人們對太陽逐漸恐懼起來。有此人類為防止太陽光線對肌膚造成傷害所進(jìn)行的研究也成為永恒課題。我們先來回顧一下紫外線的相關(guān)知識。紫外線是位于日光高能區(qū)的不可見光線。依據(jù)紫外線自身波長的不同，可將紫外線分為三個(gè)區(qū)域。即短波紫外線、中波紫外線和長波紫外線。 短波紫外線：簡稱UVC。是波長200280nm的紫外光線。短波紫外線在經(jīng)過地球表面同溫層時(shí)被臭氧層吸收。不能達(dá)到地球表面，對人體產(chǎn)生重要作用。中波紫外線：簡稱UVB。是波長280320nm的紫外線。中波紫外線對

3、人體皮膚有一定的生理作用。此類紫外線的極大部分被皮膚表皮所吸收，不能再滲入皮膚內(nèi)部。但由于其階能較高，對皮膚可產(chǎn)生強(qiáng)烈的光損傷，被照射部位真皮血管擴(kuò)張，皮膚可出現(xiàn)紅腫、水泡等癥狀。長久照射皮膚會出現(xiàn)紅斑、炎癥、皮膚老化，嚴(yán)重者可引起皮膚癌。中波紫外線又被稱作紫外線的曬傷（紅）段，是應(yīng)重點(diǎn)預(yù)防的紫外線波段。 長波紫外線：簡稱UVA。是波長320400nm的紫外線。長波紫外線對衣物和人體皮膚的穿透性遠(yuǎn)比中波紫外線要強(qiáng)，可達(dá)到真皮深處，并可對表皮部位的黑色素起作用，從而引起皮膚黑色素沉著，使皮膚變黑，起到了防御紫外線，保護(hù)皮膚的作用。維生素C（抗壞血酸）：顯示抗壞血酸生物活性的化合物的通稱，是一種水

4、溶性維生素，水果和蔬菜中含量豐富。在氧化還原代謝反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，缺乏它可引起壞血病。性質(zhì)： 外觀：無色晶體 熔點(diǎn)：190 - 192 沸點(diǎn)：（無） 紫外吸收最大值：245nm 熒光光譜：激發(fā)波長無nm，熒光波長無nm； 溶解性：水溶性維生素 比旋度：+20.5°至+21.5°分子式：C6H8O6 分子量：176.13 IUPAC名：2,3,5,6-四羥基-2-己烯酸-4-內(nèi)酯 酸性，具有較強(qiáng)的還原性，加熱或在溶液中易氧化分解，在堿性條件下更易被氧化，為己糖衍生物。紫外線誘發(fā)DNA的損傷：紫外線屬非電離化輻射，它的一個(gè)顯著特點(diǎn)是具有多種生物效應(yīng)。紫外線作用于細(xì)胞后，其光子能

5、量被原子或分子吸收，引起分子原子電子能級狀態(tài)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相關(guān)事件出現(xiàn)。研究表明，有機(jī)分子中的共軛鍵能吸收較短波長的Uv射線，而線性重復(fù)結(jié)構(gòu)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)則吸收較長波長的UV射線晤勁。而DNA_L的堿基以及某些氨基酸包含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和共軛鍵結(jié)構(gòu)(如，磷酸核糖長鏈或核糖)，所以在細(xì)胞中主要是DNA吸收Uv射線，UV射線將首先損傷細(xì)胞中的染色體，從而使DNA上的基因受到損傷。這種損傷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生突變。紫外線造成的DNA的損傷形式主要包括AP位點(diǎn)、嘧啶二聚體以及蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)、DNADNA交聯(lián)或單鏈斷裂等。紫外輻射是遠(yuǎn)古生物進(jìn)化至今一直上法擺脫的環(huán)境濟(jì)變因子。紫外輻射導(dǎo)致活性氧自由基

6、如。q，q一，血I的產(chǎn)生量增加，引起細(xì)胞膜損傷及DNA損傷，促進(jìn)皮膚老化和皮膚癌的發(fā)生。因此，尋求高效的活性氧自由基拮抗劑(擾氧化劑)是預(yù)防和治療紫外輻射損傷的重要于段之一。維生素c能否對I)NA損傷起保護(hù)作用，對DNA紫外損傷的影響與其濃度又有什么關(guān)系，我們應(yīng)用拉曼光譜研究不同濃度的維生索c對紫外線誘發(fā)的DNA損傷的影響。1928年，印度科學(xué)家拉曼(CVRaman)與KsKri shnan報(bào)告了他們在液體和蒸汽中發(fā)現(xiàn)的1種新的光散射現(xiàn)象。當(dāng)一束光照入射到分子上時(shí)，除了產(chǎn)生與入射光頻率v。相同的散射光以外(Rayleigh散射)，還有頻率為v。±v的散射光，是與分子振動或轉(zhuǎn)動相關(guān)的頻

7、率。這種光散射現(xiàn)象后來被稱為拉曼散射“9。然而拉曼散射效應(yīng)是一個(gè)非常弱的過程，直到60年代激光問世以后，才迅速地發(fā)展成一門嶄新的激光拉曼光譜技術(shù)。因?yàn)榧す饫庾V所測量的是散射物質(zhì)的拉曼頻移(入射光與散射光的頻率差)，表征物質(zhì)分子轉(zhuǎn)動和振動能級特性，所以通過物質(zhì)的拉曼光譜分析可以從分子結(jié)構(gòu)上了解物質(zhì)的構(gòu)成、特性及其變化規(guī)律。在常規(guī)拉曼光譜的基礎(chǔ)上，已經(jīng)發(fā)展形成了激光共振拉曼、表面增強(qiáng)拉曼、傅立葉變換拉曼、時(shí)間分辨拉曼以及共焦顯微拉曼等多種激光拉曼光譜技術(shù)?！睂?shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)材料：測試用的小牛胸腺DNA購自德國SerVa公司，為白色固體纖維，放于冰箱中以4保存。維斑索c注射液購自普通藥店。測試前用pH

8、值為7O的重蒸水配置6份DNA、維生素c和Na2鼢的混合液。其中I州A的濃度均為5，s)。為o045 n10l-L。1(作為內(nèi)標(biāo))，維生索c的濃度分別為008，015，035，O 45，0 65和10 rnrno卜L 1，每份樣品實(shí)騎前均密封保存，在冰箱里放置48 h以達(dá)到充分水合。實(shí)驗(yàn)方法：拉曼散射測試在法國Jc)b·nYvon公司的玨tD2型雙單色儀上進(jìn)行，儀器掃描及數(shù)據(jù)接受由電腦聯(lián)動控制，激光光源為美國G)hc咖t公司的IIll、ova70型氬離子激光器，激光波長為5145 I1，111，出射功率為200 rnW。雙單色儀狹縫為500500500實(shí)驗(yàn)為90。方向散射幾何裝置，室

9、溫23，濕度75。樣品用消毒紫外燈(主要是波長為2537的紫外光在起作用)分別照射10和30min,，用美閏EGG公司的460一l型數(shù)字功率計(jì)測出光的輻射照度為1868 w·m。所有樣品的激光拉曼譜在同樣實(shí)驗(yàn)條件下測出。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以上，再進(jìn)行累加、平滑等數(shù)據(jù)處理，譜圖的峰位誤差不超過1/2cm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：我們通過拉曼光譜檢測獲得了小牛胸腺DNA受不同波段紫外光照射后其分子結(jié)構(gòu)和各組分的損傷情況，分析結(jié)果表明紫外輻射不僅對脫氧核糖及各個(gè)堿基產(chǎn)生損傷，而且對DNA的B型骨架結(jié)構(gòu)也有明顯的影響。不同波段的紫外線對小牛胸腺DNA產(chǎn)生的損傷各具特點(diǎn)對維生素c水溶液單獨(dú)作了紫外輻射，發(fā)現(xiàn)經(jīng)

10、過10和30墑n的紫外輻射，維生素c的拉曼光譜與未照射相比沒有變化。可見維生素c在紫外輻射中分子結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。因此用DNA與不同濃度的維生素c混合液的拉曼光譜分別減去相應(yīng)的維生素c溶液的拉曼光譜就可得到受損的DNA光譜圖。下圖為不同濃度VC中DNA的損傷的拉曼光譜；我們曾將未加維生素c的小牛胸腺DNA樣品進(jìn)行紫外輻射9和20 nun，發(fā)現(xiàn)9嘶n的紫外輻射嚴(yán)重影響DNA的構(gòu)象，使DNA的構(gòu)型發(fā)生變化，嘧啶、嘌呤堿基及脫氧核糖都受到破壞堿基問的氫鍵也造成斷裂。而20嘶n的紫外輻射對DNA造成了全面損傷，已看不到一個(gè)有意義的峰。從表1和圖1圖5不難看出，維牛素c既可保護(hù)I)NA，降低它的紫外損傷

11、程度，又可促進(jìn)DNA的損傷。濃度在O08O35mmol.L的維生素c對DNA紫外損傷具有明的保護(hù)作用。當(dāng)VC濃度為O08和0.15時(shí)，高波數(shù)置段的熒光本底噪聲較高，但vC濃度為035時(shí)，DNA拉曼譜圖中則看小到這種現(xiàn)象。可見VC對DNA的保護(hù)隨著其濃度的增加而愈來愈好。如果DNA不被保護(hù)，紫外照射會造成大量氫鍵斷裂，使DNA變?yōu)楹袉捂満腿鄙倌承A基的r)NA，紫外照射也會導(dǎo)致鏈間交連，形成啼啶二聚體。當(dāng)激光照射含有交連分子和基團(tuán)碎片的DNA時(shí)，拉曼譜圖的熒光乖底噪聲便會增大。因此，我們認(rèn)為O 35的vc對DNA的保護(hù)最好。當(dāng)vc濃度繼續(xù)增大，達(dá)到0 45時(shí)，經(jīng)過10min的紫外輻射，1 09

12、4 crn譜線的相對強(qiáng)度迅速降低，只有059；比不加vc時(shí)還低；熒光本底噪聲也增大。而當(dāng)vc濃度繼續(xù)增大為1時(shí)，10 min的紫外輻射使得1 094譜線的相對強(qiáng)度僅為015，表明DNA構(gòu)型兒乎全被破壞。由此不難看出高濃度的vc促進(jìn)DNA的損傷。維生素c溶液對DNA損傷和保護(hù)作用的可能機(jī)制在有氧存在的情況下，DNA水溶液經(jīng)紫外照射可能產(chǎn)生了自由基。自由基本身性質(zhì)活潑，具有強(qiáng)氧化性，極易與DNA反應(yīng)。自由基攻擊DNA通常表現(xiàn)為DNA單鏈斷裂、DNA雙鏈斷裂、交聯(lián)等堿基損傷以及分子水平上出現(xiàn)無嘌呤位點(diǎn)、5一羥甲基尿嘧啶、8一羥基脫氧鳥嘌呤，如OH·自由基可以直接與DNA的臨近位置結(jié)合，引起

13、DNA分子中嘌呤、啼啶或戊糖成分的改變，造成DNA空間構(gòu)象的改變、DNA單鏈、雙鏈的斷裂損傷、DNA-DNA交聯(lián)等反應(yīng)，單鏈斷裂中約10是由OH引起的。維牛素c是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，它具有清除自由基的能力，這種清除自由基的作用在紫外線照射過程中隨自由基大量產(chǎn)生而得到發(fā)揮。因此維生素c濃度在O35以下時(shí)可以保護(hù)DNA，降低紫外輻射的損傷。而當(dāng)維生素c的濃度較高時(shí)，由于紫外輻射產(chǎn)生的自由基的數(shù)量可能有限，自由基已被清除，維牛素c仍有剩余，維生素c的較強(qiáng)的酸性和較強(qiáng)的還原性再加上紫外輻射一起作用于DNA，可能對DNA造成了更大的損傷。，從圖5可看出當(dāng)維生素c濃度超過035 mmol·L時(shí)，