四、三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)跑出來的結(jié)果：.

1、四、三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)跑出來的結(jié)果:左圖(Fig. 14-a)之電泳圖為未使用SDS處理之三樣本X,Y, Z所跑出的結(jié)果，分子量及淨(jìng)電荷密度均影 響泳動(dòng)率，三樣本原本之電性都未改變，由於電泳方向設(shè)定為帶負(fù)電之樣本由負(fù)極跑向正極，Z反而向上方之正極趨近，因其帶正電，所以膠體上看不到Z的帶，而X由四小集團(tuán)組成之分子大於Y，所以Y會(huì)跑的較遠(yuǎn)而較接近正極，因大分子阻力較大。右圖(Fig. 14-b)為以SDS處理後之樣本所跑出的電泳圖，只有分子量影響泳動(dòng)率，三樣本皆帶負(fù)電，往正極移動(dòng)，且SDS會(huì)解開蛋白質(zhì)之folding結(jié)構(gòu)，SDS-PAGE又有加入B -mercaptoethano,其會(huì)打斷 pep

2、tide間之雙硫鍵，故樣本都是以簡單polypeptide形式去電泳，X被分成四小單元故最小而跑最遠(yuǎn)，但 跑樣本X之跑道上有出現(xiàn)一小帶，其為處理不完全之 X樣本，其還是tetramer，最大故最接近負(fù)極，Z最 小所以跑最遠(yuǎn)而最接近正極。Fig. 14 Native-PAGE （b） SDS-PAGEX 為 tetramer （分子量:40000 >4），Y（分子量:88000）、Z（分子量:60000）為 monomer； pH8.3 之情況下：NATIVE PAGE （X，Y帶負(fù)電；Z帶正電）;SDS-PAGE （皆帶負(fù)電 ）判讀SDS-PAGE結(jié)果數(shù)據(jù)：內(nèi)插法作圖kDa330220k

3、DaMigration (R f)3618.567609467433020.114.4Fig. 15單元體分子量的測(cè)定(SDS-PAGE)，由電泳結(jié)果之樣本移動(dòng)距離依內(nèi)插法作一線性圖求分子量。X軸：分子量(kDa) 丫軸：泳動(dòng)率(Rf)五、蛋白質(zhì)染色法及原理:根據(jù)結(jié)構(gòu)之特徵(Fig. 16)，即因含有特定side chain而和染劑產(chǎn)生作用，故達(dá)到染色效果, 有兩種方法，第一種方法：將硝酸銀溶於硝酸溶液中，產(chǎn)生銀氨錯(cuò)離子，用此可 染蛋白質(zhì)中含有Lys部分，銀離子會(huì)還原成金屬銀而附著在Lys之side chain上,產(chǎn)生深褐色反應(yīng)產(chǎn)物。第二種方法：使用coomassie blue R (red)

4、調(diào)整其pH值，使其呈藍(lán)色，可染Lys及Arg之side chain部分，而達(dá)到染色效果。金屬銀沉澱Ammon iacalsilver+ AgNH2更G l u *NHC C(Cys)還H2NAg還原+HqN. Ag.NH33LysSO-+ SO3N H3CCoomassieBlue RFig. 16兩種主要蛋白質(zhì)染色法:N = NOHSO3NHSO3OORCRORO+ HCCCHG lutaraldehyde1. Ammo ni acal silverR3Arg +n h 2HNC NH2CcH COHOONHSO3N = NOHC OH RR SC2. Coomassie blue R六、電

5、泳膠體蛋白質(zhì)的溶離：使用little blue tank直接挖出膠體進(jìn)行溶離或定序(Fig. 17-a)，使用little blue tank進(jìn)行電泳(Fig. 17-b)，將溶離出之樣本經(jīng) 通電後會(huì)集中在tank端，有助於吸出並收集(Fig. 17-c)。(b)(c)Fig. 17 (a)將有色帶呈現(xiàn)之膠體部分挖岀並收集在溶離槽內(nèi) 代表電泳泳動(dòng)聚集方向(b) little blue tank (c)通電進(jìn)行電泳前(上卜後(下)之情況，箭頭七、電泳槽及相關(guān)設(shè)備r(a)(b)(c)Fig. 18 (a)電泳槽(左)、鑄膠器(右)(b)轉(zhuǎn)印三明治(左)、轉(zhuǎn)印槽(中，右)(c)供電器一般電泳使用迷你

6、電泳槽，而SDS-PAGE使用其專用之電泳槽肆：免疫轉(zhuǎn)印法通電使膠體上之色帶轉(zhuǎn)印至nitrocellulose上(Fig. 19-a)，先以ponceau染nitrocellulose,確定轉(zhuǎn)印是否成功，有紅色色帶呈現(xiàn)即表示轉(zhuǎn)印成功，在以清水洗淨(jìng)，進(jìn)而已抗體偵測(cè)呈色(Fig. 19-b)。(a)GeONitrocellulose(b)電泳膠體CoomassieBlueStai ningFig. 19轉(zhuǎn)印三明治，箭頭代表轉(zhuǎn)印方向(gel f nitrocellulos) (b)轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印紙PonceauStai ning免疫染色流程抗體偵測(cè)呈色利用抗原抗體結(jié)合之原理，原本使用放射線標(biāo)定於抗體上，後

7、來改為使用酵素，先由一級(jí)抗體和轉(zhuǎn)印 紙上的特定抗原結(jié)合，此抗原即是要找之peptide, 一級(jí)抗體可自行製備，通常選擇異源性且分子量上萬之蛋白質(zhì)去引發(fā)抗體產(chǎn)生而可作為一級(jí)抗體，再使用一抗一級(jí)抗體之二及抗體去和一級(jí)抗體結(jié)合， 其上已標(biāo)定好酵素，但若先標(biāo)定一 biotin則可達(dá)到放大信息的效果，因biotin和streptavidin有很強(qiáng)之結(jié)合力，其解離常數(shù)為10-20，而streptavidi n又能再和另三個(gè)biotin結(jié)合，此三個(gè)biot in尚在各自接一 酵素，可放大信息三倍，有時(shí)二及抗體上會(huì)標(biāo)定金屬，如：金 (Fig. 20-b)，抗體抗原之專一性結(jié)合完畢 後，加入受質(zhì)作用，受酵素催化

8、行程不溶性產(chǎn)物而堆積在酵素作用周圍，就能顯示欲找之樣本所在(Fig.20-c)。免疫轉(zhuǎn)印法之靈敏度比硝酸銀染色法高。(a)(b)(c)Au2eP pP P P2質(zhì)生成物Fig. 20免疫轉(zhuǎn)印之選用專一性組合單元，及(b)種類，與(c)呈色機(jī)制p p p pFig. 20免疫轉(zhuǎn)印之選用專一性組合單元，及(b)種類，與(c)呈色機(jī)制等電焦集法:蛋白質(zhì)之帶電性會(huì)隨著環(huán)境pH而改變，當(dāng)處於等電點(diǎn)時(shí)，其靜電荷為零，故在電泳時(shí)會(huì)停止移動(dòng)，利 用此原理能進(jìn)行等電焦集法進(jìn)而達(dá)到分離之目的(Fig. 21)。+ + +Fig. 21 pl值為7之蛋白質(zhì)進(jìn)行等電焦集電泳，當(dāng)泳動(dòng)至pH值為7之環(huán)境時(shí)會(huì)停止移動(dòng)蛋白質(zhì)

9、在低於其靜電荷為正；若在高於其 pl值之環(huán)境下其靜電荷為負(fù)pl值之環(huán)境下，其伍：Proteomics一、組合不同數(shù)目胺基與酸基可合成多種pl的混合物：商業(yè)上之應(yīng)用藉由控制分子上正負(fù)電性基團(tuán)之?dāng)?shù)目而造成多種pl之混合物。第一次元先進(jìn)行等電焦集電泳於一長條平面上，接著再進(jìn)行第二次元之 SDS PAGE電泳，即先將樣本 以等電不同之特性先分離，在進(jìn)行和等電焦集電泳方向垂直之 SDS PAGE電泳，利用分子大小不同作 進(jìn)一部區(qū)分(Fig. 22)。Isoelectric Poi ntpH4567kD 100i 50I25I 3 ISDSPAGESDS-PAGE依分子大小不同將蛋白質(zhì)Fig. 22二次元電泳：橫向利用等電焦集法依等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)初步分離，接著縱向利用 進(jìn)行進(jìn)一步分離MALDI-TOFMass spectrumGCGDatabase searchi ngAmi noacidseque ncingCapillaryElectrophoresisHPLC二、蛋白質(zhì)體綜觀蛋白質(zhì)的消長與身分：將樣本進(jìn)行2D電泳，從膠體中挖出欲分析之部分，將其中之蛋白質(zhì)溶離並用酵素切成小片段，接著將 這些小片段分兩路進(jìn)行不同分析，一方面進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析得各小片段之分子量；另一方面以HPLC依極性不同進(jìn)行分