探析ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘大鼠氣道重塑中的作用

1、探析ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘大鼠氣道重塑中的作用<        摘要：  目的 研究在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞ASMC（airway smooth muscle cell）中ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)哮喘氣道重塑中的作用。方法 原代培養(yǎng)ASMC,實(shí)驗(yàn)設(shè)未干預(yù)組（A組）、ERK阻斷劑（U0126）組（B組）、PDGF組（C組）、PDGF+ERK阻斷劑組（D組）。B組又分為B1組、B2組、B3組、B4組,加入濃度分別為0.1mol/L、1mol/L、5mol/L、10mol/L的U0126；C組又分為C1組、

2、C2組、C3組、C4組，加入濃度分別為1g/L、10g/L、25g/L、50g/L的PDGF-BB。免疫組化法測(cè)ERK1蛋白的表達(dá)(僅測(cè)A、B4、C4、D組)，RT-PCR法測(cè)其mRNA表達(dá)。結(jié)果 ASMC中ERK1蛋白表達(dá)B4組顯著低于A組（P<0.01），C4組顯著高于A組（P<0.01），D組與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B1組、B2組、B3組、B4組ERK1 mRNA表達(dá)均顯著低于A組（P<0.01），U0126以濃度依賴性的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)ASMC中ERK的活化；C1組、C2組、C3組、C4組ERK1 mRNA表達(dá)均顯著高于A組（P&l

3、t;0.01），ERK1 mRNA的表達(dá)與PDGFBB存在明顯的濃度依賴關(guān)系，D組則與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 PDGF可劑量依賴地激活哮喘大鼠ASMC內(nèi)的ERK通路，ERK通路參與了PDGF誘導(dǎo)的ASMC增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。 關(guān)鍵詞：  哮喘 大鼠 氣道重塑 氣道平滑肌細(xì)胞  氣道重塑（airway remodelling）是支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）的特征性病理生理改變之一，1992年哮喘“氣道重塑（airway remodeling）”的概念被明確提出。氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)增殖在氣道重構(gòu)中占有十分重要的地位,有報(bào)道顯示哮喘病人氣道平

4、滑肌厚度是對(duì)照組的3倍1，故體外氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMC)培養(yǎng)是研究哮喘發(fā)病機(jī)制的重要手段。ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi),是MAPK信號(hào)通路的3個(gè)家族成員之一，已發(fā)現(xiàn)它在氣道平滑肌上廣泛分布,主要以ERK1、ERK2兩種亞型存在2，3。ERK主要介導(dǎo)生長(zhǎng)因子如血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF21)等的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)體外培養(yǎng)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞、PDGF-B

5、B刺激哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖，以及ERK特異性抑制劑U0126阻斷ERK通路后,觀察ERK1蛋白及其mRNA在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況,探討ERK信號(hào)通路對(duì)哮喘氣道重塑的作用。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料  （1）主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(法國(guó)Biowest公司),胎牛血清(法國(guó)Biowest公司),胰蛋白酶(法國(guó)Biowest公司),大鼠抗小鼠-actin單克隆抗體(武漢博士德公司),兔抗大鼠Smad 6/7多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，重組大鼠PDGF-

6、BB（美國(guó)R&D公司），U0126（美國(guó)Cell Singnal Technology公司），Trizol(美國(guó)Invitrogen公司),RT-PCR試劑盒(美國(guó)Fermentas公司),ERK1和GAPDH引物(上海生工合成)序列如下:ERK1上游引物:5-GACTCCTACCTGAAGCATAC-3,ERK1下游引物:5-TCCTTGACACGCAGAATG-3,產(chǎn)物203bp;GAPDH上游引物:5-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3,GAPDH下游引物:5-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3,產(chǎn)物140bp。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD（Sp

7、ragueDawlay）大鼠5只，46周，體重120160g，溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。    1.2  實(shí)驗(yàn)方法  （1）哮喘動(dòng)物模型的建立：致敏階段，第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5ml內(nèi)含OVA1mg和Al(OH)3100mg；激發(fā)階段，第15天開始以1OVA生理鹽水溶液霧化吸入，隔天1次，每次30min，共60d，以備下一步哮喘大鼠ASMC培養(yǎng)所用。（2）哮喘大鼠ASMC的培養(yǎng)和鑒定:取已建立哮喘模型大鼠，以膠原酶-胰酶混合消化法培養(yǎng)哮喘大鼠ASMC,細(xì)胞生長(zhǎng)融合后,用0.25%的胰蛋白酶消化,以（107108

8、）·L-1的密度傳代培養(yǎng),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)細(xì)胞內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白-actin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,>95%的細(xì)胞呈陽(yáng)性著色,證實(shí)細(xì)胞為ASMC；取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的35代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。（3）哮喘大鼠ASMC的分組：哮喘大鼠ASMC按加入藥物及濃度的不同分為未干預(yù)組（A組）,加無(wú)血清DMEM 2ml；ERK阻斷劑組（B組）,根據(jù)藥物干預(yù)濃度不同分為B1、B2、B3、B4四組，分別加含U0126濃度為0.1mol/L、1mol/L、5mol/L、10mol/L的DMEM 2ml；PDGF組（C組）,根據(jù)藥物干預(yù)濃度不同分為C1、C2、C3、C4四組，分別加濃度1g/L、10g/L

9、、25g/L、50g/L的DMEM 2ml；PDGF+ERK阻斷劑組（D組），加含PDGF-BB和U0126的濃度分別為50g/L和10mol/L的DMEM 2ml。（4）哮喘大鼠ASMC的藥物干預(yù):細(xì)胞按6×103/cm2的密度接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至接近融合時(shí)，吸出培養(yǎng)液，D-Hanks液洗細(xì)胞，加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，細(xì)胞饑餓24h，使細(xì)胞同步化于G0期，加入不同濃度的PDGF-BB和U0126,作用一定時(shí)間后，無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞，等待下一步實(shí)驗(yàn)。    1.3  免疫組化SP法檢測(cè)細(xì)胞ERK1蛋白表達(dá)  哮

10、喘大鼠ASMC內(nèi)ERK1蛋白的表達(dá):從6孔板內(nèi)取出爬有細(xì)胞的蓋玻片,用SP法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,胞質(zhì)內(nèi)棕黃色沉淀為陽(yáng)性結(jié)果,應(yīng)用image-pro plus圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性部位的平均吸光度(mean optical density,MOD)，用以代表陽(yáng)性部位的蛋白表達(dá)水平。    1.4  RT-PCR法測(cè)ASMC內(nèi)ERK1 mRNA的表達(dá)  提取哮喘大鼠ASMC總RNA，取1l RNA樣品加99l DEPC處理的水中，混勻，采用紫外分光光度法測(cè)定OD260、OD280的值。RNA純度以     

11、;   【內(nèi)容導(dǎo)航】         第1頁(yè)：探析ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘大鼠氣道重塑中的作用        第2頁(yè)：探析ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘大鼠氣道重塑中的作用            第3頁(yè)：探析ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在哮喘大鼠氣道重塑中的作用   

12、0;             OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.82.0之間。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系體積為30l,GAPDH和ERK1同管擴(kuò)增,每管加總RNA約1g。RT-PCR反應(yīng)條件為:42反轉(zhuǎn)錄60min,94預(yù)變性5min,然后92 30s,54 30s,72 30s反應(yīng)37個(gè)循環(huán),72充分延伸8min,4終止反應(yīng)。產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳,用SmartView凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,ERK1 mRNA的相對(duì)含量用ERK1與GAPDH吸光度的比值表示。

13、    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  用SPSS 10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（x±s）表示,兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。    2  結(jié)果    2.1  ASMC內(nèi)ERK1蛋白表達(dá)  ASMC中ERK1蛋白表達(dá)，B4組（0.18±0.05）顯著低于A組（0.31±0.03），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01；C4組（0.68±0.02）顯著高于A

14、組（P<0.01）；C4組顯著高于B4組（P<0.01）；D組（0.33±0.02）與A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1，表1。    A: 免疫組化法示ASMC中A組ERK1表達(dá)  B: 免疫組化法示ASMC 中B組ERK1表達(dá)降低C: 免疫組化法示ASMC中C組ERK1表達(dá)增加  D: 免疫組化法示ASMC中D組ERK1表達(dá)無(wú)明顯變化圖1  各組ASMC內(nèi)ERK1蛋白的表達(dá)(×200)表1  免疫組化檢測(cè)各組哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞ERK1蛋白表達(dá)注：與A組比較，*P&

15、lt;0.01  2.2  ASMC內(nèi)ERK1 mRNA的表達(dá)  B1組、B2組、B3組、B4組ERK1 mRNA表達(dá)均顯著低于A組（P<0.01），U0126以濃度依賴性的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)ASMC中ERK的活化；C1組、C2組、C3組、C4組ERK1 mRNA表達(dá)均顯著高于A組（P<0.01），ERK1 mRNA的表達(dá)與PDGFBB存在明顯的濃度依賴關(guān)系，D組與A組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2，表2。表2  各組ASMC ERK1 mRNA的表達(dá)注：與A組比較，*P<0.01；與B1組比較，P<0

16、.01；與B2組比較，P<0.01；與B3組比較，P<0.01；與C1組比較，#P<0.01；與C2組比較，P<0.01；與C3組比較，P<0.01。    3  討論    3.1  PDGF促ASMC增殖的作用及可能機(jī)制  PDGF主要存在于血小板顆粒中,當(dāng)血小板粘附于損傷組織,暴露于凝血酶、膠原和二磷酸腺苷時(shí),PDGF就被釋放出來(lái)。另外,單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、系膜細(xì)胞等均可產(chǎn)生和釋放PDGF。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞、激活的血小板、移行于內(nèi)皮下的單核巨噬細(xì)胞

17、及表型轉(zhuǎn)化后的合成型平滑肌細(xì)胞能以自分泌、旁分泌連鎖放大反應(yīng)形式釋放大量的PDGF。釋放的PDGF能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(SMC)的有絲分裂,尤其對(duì)SMC的作用更明顯,使細(xì)胞由G1/G0的靜止期進(jìn)入到細(xì)胞周期的增殖期4。PDGF包括PDGF-A與PDGF-B兩個(gè)同分異構(gòu)體，PDGF蛋白家族由4個(gè)基因(PDGF-A,-B,-C,-D)編碼,包括4同二聚體(PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)及1個(gè)異二聚體(PDGF-AB)五個(gè)亞型，其相應(yīng)的受體有與兩個(gè)亞型(PDGFR及PDGFR)，屬于典型的酪氨酸蛋白激酶型受體。研究表明，PDGF與平滑肌細(xì)胞的增

18、殖有關(guān)，在人造血管中是肌內(nèi)膜超常增生的關(guān)鍵因子之一5。PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑能阻止動(dòng)脈增生性疾病。Warshamana等6研究鼠3T3成纖維細(xì)胞過(guò)程中發(fā)現(xiàn)地塞米松能正向調(diào)節(jié)PDGF受體，間接地激活PDGF受體表達(dá)從而導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞增殖。另有研究7也發(fā)現(xiàn)激素重癥依賴性哮喘支氣管粘膜活檢檢測(cè)到PDGF-BmRNA的表達(dá)，并明顯高于輕癥及健康對(duì)照者，提示PDGF參與了哮喘的氣道重塑，研究顯示哮喘肺部PDGF-B mRNA主要表達(dá)于EOS，同時(shí)指出哮喘慢性炎癥作用下，外周血的EOS被激活同樣表達(dá)PDGF-B mRNA。    PDGF的作用機(jī)制與PDGF和其受體結(jié)

19、合、受體酪氨酸磷酸化、胞漿游離Ca2+濃度的變化等有關(guān)，對(duì)于PDGF引起ASMC增殖的分子機(jī)制，目前有二種推論：一是PDGF受體在細(xì)胞膜外部分?jǐn)y有與PDGF特異結(jié)合的類似免疫球蛋白的5個(gè)結(jié)構(gòu)域,在胞漿區(qū)則有酪氨酸磷激酶插入?yún)^(qū)，PDGF與受體結(jié)合后激活受體上的酪氨酸蛋白激酶，進(jìn)而激活磷脂酶C（PLC），水解二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DAG），IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上特異受體結(jié)合,通過(guò)Ca2+的釋放,使胞漿內(nèi)游離Ca2+增加，DG和Ca2+激活蛋白激酶C(PKC),繼而Ca2+和PKC活化促進(jìn)DNA的合成；二是PDGF與受體結(jié)合后激活膜上的一種小分子G蛋白（ras蛋白

20、），通過(guò)ras/GTP逐級(jí)激活MAPKKK/MAPKK/ERK通路，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂。    3.2  ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在哮喘氣道重塑中的作用  目前認(rèn)為在哮喘肺內(nèi)很多因子是通過(guò)ERK和p38 MAPK途徑激活氣道平滑肌釋放的8。早期的很多研究發(fā)現(xiàn)ras-ERK途徑的激活對(duì)于細(xì)胞增殖，DNA合成和細(xì)胞周期調(diào)控起重要作用。對(duì)中重度哮喘患者和健康者的支氣管標(biāo)本活檢研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘患者支氣管上皮和平滑肌細(xì)胞磷酸化ERK 1/2和磷酸化p38強(qiáng)表達(dá)，與中度哮喘患者和無(wú)哮喘者有顯著差異，得出1/2和p38通路調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分泌和增殖功能的結(jié)論9。國(guó)內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)，制作哮喘大鼠模