血氨濃度測(cè)定方法學(xué)研究

1、血氨濃度測(cè)定方法學(xué)研究    【摘要】  目的：建立紫外分光光度法檢測(cè)血液中的氨濃度的方法，為臨床肝性昏迷、肝性腦病、重型肝病、尿毒癥等代謝障礙疾病的診斷提供參考。方法：血液離體后，立即加入定量過量的鎢酸鈉及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時(shí)，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚-次氯酸鈉顯色后于波長(zhǎng)630 nm處測(cè)定光密度OD值（以空白校正）。結(jié)果：血氨在2060 mol/L范圍內(nèi)濃度與OD之間呈良好的線性。結(jié)論：此方法快速、簡(jiǎn)便，適合臨床檢測(cè)血氨的濃度。 【關(guān)鍵詞】  血氨；方法學(xué)；光密度正常人體內(nèi)游離血氨（blood am

2、monia，BA）含量極低（正常值2060 mol/L）1，其主要來(lái)源于體內(nèi)蛋白質(zhì)在代謝過程中產(chǎn)生的氨基酸，以及經(jīng)脫氨作用分解而來(lái)的內(nèi)源性氨，正常情況這種氨可形成酰胺及合成其他含氮化合物而不斷地被轉(zhuǎn)化；另一來(lái)源是蛋白質(zhì)類食物在腸道內(nèi)經(jīng)細(xì)菌分解而成的外源性氨，正常情況下此氨經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟被合成為脲，經(jīng)腎臟排出體外。然而在發(fā)生代謝障礙性疾病，如肝性昏迷、肝性腦病、重型肝炎、尿毒癥等由于氨不能正常代謝排出體外而引起B(yǎng)A升高。肝功能極度衰竭或血液不能正常地流經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)換等嚴(yán)重肝臟疾病，氨不能從循環(huán)中及時(shí)清除均可使血氨增高1。高BA有神經(jīng)毒性，BA的測(cè)定對(duì)于肝硬化門脈高壓、肝昏迷、Reves綜合征及兒科

3、的一些先天性代謝紊亂等病的診斷、觀察和預(yù)后判斷有著重要意義2。BA的測(cè)定方法有微量擴(kuò)散法、比色法、離子交換法、氨電極法、酶法等。筆者在結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)BA方法，為臨床該類疾病的診斷、治療提供參考。1  儀器與試劑1.1  儀器    電子天平 COBS?120型（朝鮮COBS公司），紫外分光光度儀HP8453（美國(guó)惠普），離心沉淀器800型（上海手術(shù)儀器廠），YKH?I型液體快速混勻器（江西醫(yī)療器械廠），DHW?420三用電熱恒溫水箱（北京東霞科學(xué)儀器廠）。1.2  試藥 

4、0;  鎢酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)030906），硫酸銨（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號(hào)050329），亞硝基鐵氰化鈉（上海三愛思試劑公司，批號(hào)20020204），苯酚（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20000924），氫氧化鈉（重慶川江化學(xué)試劑廠，批號(hào)20000312），次氯酸鈉（重慶川東化工集團(tuán)化學(xué)試劑廠，批號(hào)20040904），硫酸銨（重慶北碚化學(xué)試劑廠，批號(hào)050329），硫酸（重慶川江化學(xué)試劑廠，批號(hào)20000105），所用試藥均為分析純，水為新制無(wú)氨蒸餾水。2  方法與結(jié)果2.1  儲(chǔ)備溶液的配制2    無(wú)氨水的制備：參照

5、文獻(xiàn)3取重蒸水1 000 mL，加稀硫酸1 mL與高錳酸鉀試液1 mL，蒸餾即得備用。    酚顯色劑：精取亞硝基鐵氰化鈉25.00 mg，與適量苯酚混合后加無(wú)氨水至100 mL,過濾即得。    堿性次氯酸鈉溶液：精取250 mg次氯酸鈉，氫氧化鈉2 500 mg，溶于100 mL無(wú)氨水中即得。    0.5 mol/L硫酸溶液、5 mmol/L硫酸銨溶液參照文獻(xiàn)方法3配制。2.2  標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制  分別精取“2.1”項(xiàng)的硫酸銨儲(chǔ)備液20、200、500、1 000、1 500、2

6、 000、4 000 L置于50 mL容量瓶，立即加無(wú)氨水至刻度即得10、20、50、100、150、200、400 mol/L的硫酸銨系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.3  標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備    取“2.2”項(xiàng)的硫酸銨系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別加入10 %的鎢酸鈉溶液、0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 mL，渦旋震蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，分取上清液1 mL，依次加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉溶液各1 mL，渦旋1 min后置37 水浴20 min，以空白管校正后于630 nm處測(cè)定OD值；將所測(cè)得的吸收度OD值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸處理得回歸方

7、程：OD=0.0017C+0.23，相關(guān)系數(shù)r=0.9964，根據(jù)(NH4)2SO4與游離氨的定量關(guān)系，即得游離氨濃度在5200mol/L的定量線性范圍（見圖1）。2.4  臨床樣本的測(cè)定    參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)優(yōu)化后測(cè)定BA的方法為：離體血液立即加入過量定量的10%鎢酸鈉及0.5 mol/L硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時(shí)，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚?泊溫人崮葡隕?劑顯色后于波長(zhǎng)630 nm處測(cè)定OD值，即可定量測(cè)定BA。百事通 2.5  方法的回收試驗(yàn)    按“2.2”項(xiàng)的方法分別配制

8、高、中、低（400、200、40 mol/L）的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，各取1mL分別加入1 mL無(wú)氨正常血漿，混勻后精密量取1 mL按2.4項(xiàng)下的方法分別精密加入0.5 mL 10 %鎢酸鈉和0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 mL，以下按準(zhǔn)曲線項(xiàng)下相應(yīng)的方法處理并分別測(cè)定其OD值，將測(cè)得的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得量與回收率，結(jié)果見表1。表1  血氨回收試驗(yàn)（略）2.6  精密度試驗(yàn)    配制低、中、高（25、50、75 mol/L）3個(gè)濃度含無(wú)氨正常血漿的硫酸銨溶液各3份，日內(nèi)4 冷藏保存，每間隔1 h按2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定1次，連

9、續(xù)測(cè)定5次。另取相同樣品?18 冷凍保存，每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5日。所得OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得游離氨濃度，結(jié)果見表2。表2  血氨精密度試驗(yàn)（略）2.7  穩(wěn)定性試驗(yàn)    取硫酸銨溶液適量配制成75 mol/L含無(wú)氨正常血漿的硫酸銨溶液，分別置于4 冰水浴和?18 條件下儲(chǔ)藏保存，每次平衡5 min后各取1 mL樣品，按“2.6”精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的測(cè)定方法，4 下保存的標(biāo)本在1 d內(nèi)每間隔2 h測(cè)定1次，每次平行測(cè)定5份，直至14 h共測(cè)定8次；?18 條件下保存的標(biāo)本每天定時(shí)測(cè)定1次，每次平行測(cè)定5份，連續(xù)測(cè)定7 d，將測(cè)得的OD值通

10、過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算游離氨的實(shí)際含量，結(jié)果見表3。由表可知新鮮血中游離氨極不穩(wěn)定，常溫和4 冷藏保存均不穩(wěn)定，宜在2 h內(nèi)測(cè)定，在?18 下保存也宜在24 h內(nèi)測(cè)定。表3  血氨穩(wěn)定性試驗(yàn)（略）2.6  臨床應(yīng)用    選擇我院近2年來(lái)的住院患者，除外肝、膽、腎疾病患者。腦梗塞患者28例，其中男16例，女12例，平均年齡（55.8±10.5）歲；腦溢血患者25例，其中男15例，女10例，平均年齡（60.4±15.4）歲；腦炎患者10例，其中男6例，女4例，平均年齡（39.8±13.5）歲。全部病例均經(jīng)臨床及CT和（或

11、）MRI檢查。對(duì)照組25例，經(jīng)檢查全部健康正常，其中男13例，女12例，平均年齡（57.2±14.3）歲。全部患者均在昏迷期及恢復(fù)期各采取肘靜脈血12 mL，肝素抗凝，立即用上述方法測(cè)定血氨，對(duì)照組也同時(shí)采血測(cè)定血氨。    結(jié)果對(duì)照組血氨含量為（56.53±29.15）mol/L，腦梗塞組昏迷期血氨含量為（179.00±108.59）mol/L，恢復(fù)期為（66.89±26.67）mol/L，昏迷期與對(duì)照組經(jīng)2檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=12.68，P<0.05），恢復(fù)期與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=5.42，P&g

12、t;0.05）。腦溢血組昏迷期血氨含量為（146.97±72.41）mol/L，恢復(fù)期為（60.46±24.39）mol/L，昏迷期與和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=11.78，P<0.05），恢復(fù)期與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.68，P>0.05）。腦炎組昏迷期血氨含量為（197.17±62.10） mol/L，恢復(fù)期為（59.83±39.59）mol/L，昏迷期與對(duì)照組顯著增高（2=9.72，P<0.05），而恢復(fù)期與對(duì)照組相比差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=3.95，P>0.05）。3  討論 

13、0;  由表3結(jié)果表明：標(biāo)本放置時(shí)間越長(zhǎng)，其血氨濃度越高，主要原因可能是血液細(xì)胞自身代謝或部分微生物代謝后產(chǎn)生氨致使其血氨濃度升高。為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確應(yīng)注明標(biāo)本的采集時(shí)間并立即送檢，送檢標(biāo)本迅速測(cè)定（30 min內(nèi)），同時(shí)進(jìn)行平行質(zhì)控監(jiān)測(cè)。病人標(biāo)本采集后如不能立即測(cè)試，應(yīng)在28 冷藏最多3 h測(cè)定，?18 冷凍保存最多24 h測(cè)定。    正常情況下，體內(nèi)大部分氨經(jīng)過尿素循環(huán)形成尿素自尿中排出，部分為機(jī)體再利用，不會(huì)產(chǎn)生蓄積，而在尿素循環(huán)障礙疾病時(shí)則將出現(xiàn)血氨蓄積，在新生兒當(dāng)血氨大于150 mol/L、嬰幼兒大于80 mol/L、成人大于70 mol/

14、L可確定為高氨血癥4?5。血氨可干擾腦的能量代謝，腦組織在氨的生成中需消耗某些輔酶、高能磷酸及大量?餐?戊二酸，引起高能磷酸化合物濃度的降低，過量氨還可能抑制丙酮酸脫氫酶活力而影響乙酰CoA的生成和乙酰膽堿的合成，干擾三羧酸循環(huán)，氨還可抑制Na+?K+?ATP酶，直接影響鉀、鈉在神經(jīng)細(xì)胞膜上的正常分布，干擾神經(jīng)傳導(dǎo)活動(dòng)，當(dāng)腦組織炎癥、缺血、缺氧時(shí)就影響了氨的代謝使氨增高。腦缺血后可導(dǎo)致生化代謝方面的變化，影響氨的平衡，腦組織內(nèi)氨水平增高。有實(shí)驗(yàn)表明，大鼠在腦循環(huán)中斷5 min后，其缺血的皮層氨含量從對(duì)照值的0.28 mmol/L升高到1.12 mmol/L。在腦組織內(nèi)，氨的解毒主要靠?餐?戊二

15、酸的氨化作用以及氨與谷氨酸結(jié)合生成谷氨酰胺，但后者的反應(yīng)需要消耗ATP，在缺血情況下?餐?戊二酸的氨化起主要作用。同時(shí)昏迷患者常常禁食，致使液體攝入減少或用脫水劑過量，從而致使血氨顯著增高。此外，由于感染、高熱等增加機(jī)體代謝，也使內(nèi)源性血氨增高。國(guó)外學(xué)者Kanamori?K等研究了小鼠體內(nèi)的氨、谷氨酰胺以及谷氨酰胺合成酶與腦病的關(guān)系，表明腦病與氨相關(guān)6。國(guó)內(nèi)李英杰等7測(cè)定22例腦梗塞患者的血氨和CSF氨含量，結(jié)果表明急性期血氨和CSF氨顯著高于對(duì)照組（P<0.01）梗塞面積與氨含量明顯相關(guān)。本文病例監(jiān)測(cè)結(jié)果：患者組昏迷期血氨水平顯著高于恢復(fù)期和對(duì)照組（P<0.01），亦表明這一病理

16、規(guī)律，提示對(duì)于腦血管病及腦炎患者、昏迷期患者，應(yīng)注意檢查血氨，以了解患者的氨代謝情況?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1李影林. 臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)M. 第1版. 吉林: 吉林科學(xué)技術(shù)出版社, 1990: 503.2孔祥云, 徐勉忠. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)M. 第1版. 武漢: 湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 1984: 11?21.3中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(二部)S. 2005年版. 2005, 附錄: 134.4Nyhan WL, Ozand PT. Atlas of metabolic diseasesM. London: Chapman Hill Medical, 1998: 167?187.5顧學(xué)范, 葉 軍. 新生兒疾病篩查M. 第1版. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2003: 227?233.6Kanamori?K, R