血管生成實(shí)驗(yàn)步驟-實(shí)驗(yàn)方法完善版

1、精選范本，供參考!無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1212 mmmm ,都會有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實(shí)驗(yàn)就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過 程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實(shí)驗(yàn)。圖一血管生成鏡檢圖實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法1 1實(shí)驗(yàn)材料1細(xì)胞HUVEC (Pr&moCeLl, C-12200, C-12203)104per w&ll2Endothelial Cell G row

2、t h M e d iLIm (Promo 匚歸C-ZZOIQ)50 |_il per well3基質(zhì)膠BD Matrigel (Growth Factor RedLicedt356231)10 pl per well4耗材血管生成載玻片TibiTreat （品牌 ibiidi, 81506；1 Slide5登疫茨光試剤Catcein AM (PtomoKine, PK-CA7O7-SO01 1 )1 ml 6.25 pg/ml)6其他細(xì)格紙1 sheet胰前(PromocelU C-41310)8 ml per T75 flask2 2實(shí)驗(yàn)方法：2.12.1 實(shí)驗(yàn)流程介紹材料名稱精選范本，供

3、參考!圖二實(shí)驗(yàn)流程圖（提前將 MatrigelMatrigel 融化，鋪于 ibidiibidi 血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液 加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）2.22.2 耗材結(jié)構(gòu)介紹圖三血管生成載玻片縱截面示意圖（MatrigelMatrigel 鋪在下孔，細(xì)胞鋪在MatrigelMatrigel 上，上孔充滿培養(yǎng)基）2.32.3 數(shù)據(jù)分析流程介紹Storage-200iMiitrigielPo lyme riati o nTutje Formation DloAccjiLiisition12 - Nd hCoverstiotlom- qmm- &

4、 nnm精選范本，供參考!圖四實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集和分析流程圖并且進(jìn)行圖像分析（WimasisWimasis 全自動分析）測量小管長度, 成環(huán)數(shù)，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。）一 實(shí)驗(yàn)步驟1 1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠1 1實(shí)驗(yàn)前一天將 MatrigelMatrigel 置于冰盒中，放入 4 4。C C 冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意: 同樣要準(zhǔn)備一些 4 4。C C 預(yù)冷的槍頭用于吸取 MatrigelMatrigel）2 2開始實(shí)驗(yàn)前，將 MatrigelMatrigel 始終保持放在冰盒中。3 3打開滅菌包裝，取出 ibidiibidi 血管生成載玻片。4 4每孔中加入

5、 1010 卩 l l MatrigelMatrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入MatrigelMatrigel，防止有MatrigelMatrigel 流經(jīng)上孔而留下殘留膠。Data AcquisitionData Analysts6 - 24 h15 min*Phase Contrast orFluorescenceImagesAutomated ImageAnalysis(Wimasis)Statistical Tests ofStimulated and ControlD?ta（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片,Data Interpretation精選范本，供參考!填滿血管生成載玻片

6、的下孔一一這樣，必然會影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。精選范本，供參考!如何判斷是否加入了合適體積的MatrigelMatrigel :我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。Insufficient Adequate Excessivevolumevolume volume如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了， 那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。2.2. 凝膠1.1.蓋上 ibidiibidi 血管生成載玻片的蓋子。2 2準(zhǔn)備一個(gè) 10cm10cm 的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。

7、3.3. 將 ibidiibidi 血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。4.4.將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置3 30 0 分鐘左右， 等待膠凝結(jié)。5.5. 等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。Preparing the humidity chamborp-Slido plsceid in the hurnidity diaimbai*r3 3、鋪細(xì)胞精選范本，供參考!加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVECHUVEC 細(xì)胞，每孔種1000010000 個(gè)細(xì)胞即可。1 1準(zhǔn)備密度為 2*105ce

8、lls/ml2*105cells/ml 的細(xì)胞懸液，充分混勻。2 2將膠已經(jīng)凝固的 ibidiibidi 血管生成載玻片從濕盒中取出。3 3每孔加入 5050 卩 l l 的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠尅? 4同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上 孔液體正好加滿。5 5蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會沉下去落在MatrigelMatrigel 的表面。Sin king process of celh. After $ome minutes all of the celk have fallen to the

9、 ground4 4、采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以按照細(xì)胞的生長速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長度， 覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測量和記錄，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析Tlmai Lapse picturss with a lOuc nnagnification nt 6 2 and 4 hours.5 5、免疫熒光染色根據(jù)需要，可以對成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。加入 5050 卩 l l 用無血清培養(yǎng)基稀釋的calceincalcein (12.5(12.5 卩 l l calceincalcein stockstock 1 1，使其終濃度 為 6.256.25 卩g/mlg/ml (1:160)(1:160)精選范本，供參考!在室溫下避光孵育 3030 分鐘。使用 PBSPBS 清洗三次，注意，PBSPBS 要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。 使用 485485 nm/nm/ 529529 nmnm 進(jìn)行免疫熒光成像。HUVEC network stained with emlcArn (6,25實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢1 1這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠，降低實(shí)驗(yàn)成本；2 2分上下