全基因組重測序數(shù)據(jù)分析詳細(xì)說明

1、全基因組重測序數(shù)據(jù)分析1. 簡介(Introduction)通過高通量測序識(shí)別發(fā)現(xiàn) de novo的somatic和germ line突變，結(jié)構(gòu)變異-SNV，包括重 排突變(deletioi n, duplicati on 以及 copy number variatio n )以及 SNP 的座位；針對(duì)重排 突變和SNP的功能性進(jìn)行綜合分析；我們將分析基因功能(包括miRNA )，重組率(Recomb in ation )情況，雜合性缺失(LOH )以及進(jìn)化選擇與mutation之間的關(guān)系；以及這些關(guān)系將怎樣使得在disease ( cancer)genome中的mutation產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的易感

2、機(jī)制和功能。我們將在基因組學(xué)以及比較基因組學(xué)，群體遺傳學(xué)綜合層面上深入探索疾病基因組和癌癥基因組。StmctumVariathnC hroiniicwiial to<n*iobp gen (HU FC>loKPne<irdetectioD.SeqtiEflce VarijifliGni* M KmJMrifelCk IlWtbln 1 Cpjii(CVh J* Ib4vIi* SrfMMLiJ 4v|MMiiiiiii* I rrwai viuIk«« KWi-CW r小命* Mw rad f-kiMihW- « mtmI HfihHAdMMMk

3、rosccppk tad subcbromosoEnjil Q-rn*a*l iaUiiLi BwiB Cl rMWB-tl BrWIlH I- laf rfrsvilv iFim< O.r*BM«ul BbHirKiLhnMolccil&r gtBCilc dt teflon實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本(1) Case-Control 對(duì)照組設(shè)計(jì)(2 )家庭成員組設(shè)計(jì)：父母-子女組(4人、3人組或多人)； 初級(jí)數(shù)據(jù)分析1.數(shù)據(jù)量產(chǎn)出：總堿基數(shù)量、Total Mapping Reads 、Uniquely Mapping Reads統(tǒng)計(jì)，測序深度分析。2 .一致性序列組裝：與參考基因

4、組序列(Refere nee gen ome seque nee)的比對(duì)分析，禾U用貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型檢測出每個(gè)堿基位點(diǎn)的最大可能性基因型，并組裝出該個(gè)體基因組的一致序列。3. SNP檢測及在基因組中的分布：提取全基因組中所有多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)量值、測序深 度、重復(fù)性等因素作進(jìn)一步的過濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對(duì)檢測到的變異進(jìn)行注釋。4 .In Del檢測及在基因組的分布：在進(jìn)行mappi ng的過程中，進(jìn)行容 gap的比對(duì)并檢測可 信的short In Del。在檢測過程中，gap的長度為15個(gè)堿基。對(duì)于每個(gè)In Del的檢測，至少 需要3個(gè)Paired-End

5、 序列的支持。5. Structure Variation 檢測及在基因組中的分布：能夠檢測到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有：插入、 缺失、復(fù)制、倒位、易位等。根據(jù)測序個(gè)體序列與參考基因組序列比對(duì)分析結(jié)果，檢測全基 因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對(duì)檢測到的變異進(jìn)行注釋。高級(jí)數(shù)據(jù)分析1.測序短序列匹配（Read Mapping ）（1） 屏蔽掉 Y染色體上假體染色體區(qū)域（pseudo-autosomal region ）,將Read與參考序 列NCBI36進(jìn)行匹配（包括所有染色體，未定位的con tig，以及線粒體序列 mtDNA （將用校正的劍橋參考序列做替代）。采用標(biāo)準(zhǔn)序列匹配處理對(duì)原始序列文件進(jìn)行基因組匹配，

6、將Read與參考基因組進(jìn)行初始匹配；給出匹配的平均質(zhì)量得分分布；（2） 堿基質(zhì)量得分的校準(zhǔn)。我們采用堿基質(zhì)量校準(zhǔn)算法對(duì)每個(gè)Read中每個(gè)堿基的質(zhì)量進(jìn) 行評(píng)分，并校準(zhǔn)一些顯著性誤差，包括來自測序循環(huán)和雙核苷酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的誤差。（3） 測序誤差率估計(jì)。pseudoautosomal con tigs，short repeat regions （包括 segme ntalduplicati on ， simple repeat seque nee- 通過 tandem repeat 識(shí)另 U算法識(shí)另 U） 將被過濾；2. SNP Calling 計(jì)算 （SNP Calling ）我們可以采用整合多種

7、SNP探測算法的結(jié)果，綜合地，更準(zhǔn)確地識(shí)別出SNP。通過對(duì)多種算法各自識(shí)別的 SNP進(jìn)行一致性分析，保留具有高度一致性的SNP作為最終SNP結(jié)果。這些具有高度一致性的 SNP同時(shí)具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP識(shí)別算法包括基于貝葉斯和基因型似然值計(jì)算的方法，以及使用連鎖不平衡 LD或推斷技術(shù)用于優(yōu)化SNP識(shí)別檢出的準(zhǔn)確性。統(tǒng)計(jì)SNV的等位基因頻率在全基因組上的分布稀有等位基因數(shù)目在不同類別的 SNV中的比率分布（a） ; SNV的類別主要考慮：（1）無 義（nonsense ） , （2）化學(xué)結(jié)構(gòu)中非同義，（3）所有非同義，（4）保守的非同義，（5） 非編碼，（6）同義，等類型SNV

8、 ;另外，針對(duì)保守性的討論， 我們將分析非編碼區(qū)域 SNV 的保守型情況及其分布（圖 a, b ）ANS o呦輻帥M30252QT5W備 OLoi.olm(>.(>.(>.(>.(>.(>. b ssv Eb- i 33. 短插入 / 缺失探測(Short In sertio n /Deletion(In del ) Call)(1) .計(jì)算全基因組的in del變異和基因型檢出值的過程計(jì)算過程主要包含 3步：(1)潛在的in del的探測；(2)通過局部重匹配計(jì)算基因型的似 然值；(3)基于LD連鎖不平衡的基因型推斷和檢出識(shí)別。In del在X，Y染色體上

9、沒有檢出值得出。(2) . I ndel過濾處理4. 融合基因的發(fā)現(xiàn)(Fusion gene Discovery )選擇注釋的基因信息來自于當(dāng)前最新版本的Ensemble Gene數(shù)據(jù)庫，RefSeq數(shù)據(jù)庫和Vega Gene數(shù)據(jù)庫。下面圖例給出的是融合基因的形成，即來自不同染色體的各自外顯子 經(jīng)過重組形成融合基因的模式圖。Gswnic 1X4如fl Mb* !- Ctiriat EtMrwjj Chf 2 U. CAACAG r OAGTATCACAD4Extm 361776177Initofl 35. 結(jié)構(gòu)變異（Structure Variation ）結(jié)構(gòu)變異（Structure Var

10、iation SV）是基因組變異的一類主要來源，主要由大片段序列（一般 >1kb）的拷貝數(shù)變異（copy number variatio n, CNV）以及非平衡倒位（un bala nee in version ）事件構(gòu)成。目前主要一些基因組研究探測識(shí)別的SV大約有20,000個(gè)（DGV數(shù)據(jù)庫）。在某些區(qū)域上，甚至 SV形成的速率要大于 SNP的速率，并與疾病臨床表型具有很大關(guān)聯(lián)。我們不僅可以通過測序方式識(shí)別公共的SV，也可以識(shí)別全新的 SV。全新的SV的生成一般在germ line和突變機(jī)制方面都具有所報(bào)道。然而，當(dāng)前對(duì)SV的精確解析需要更好的算法實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，我們也需要對(duì)SV的形成機(jī)

11、制要有更重要的認(rèn)知，尤其是 SV否起始于祖先基因組座位的插入或缺失，而不簡單的根據(jù)等位基因頻率或則與參考基因組序列比對(duì)判斷。SV的功能性也結(jié)合群體遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)結(jié)合起來，我們綜合的考察SV的形成機(jī)制類別。SV形成機(jī)制分析，包括以下幾種可能存在的主要機(jī)制的識(shí)別發(fā)現(xiàn)：（A）同源性介導(dǎo)的直系同源序列區(qū)段重組（NAHR）；（B ）與DNA雙鏈斷裂修復(fù)或復(fù)制叉停頓修復(fù)相關(guān)的非同源重組（NHR）；（C） 通過擴(kuò)展和壓縮機(jī)制形成可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）；（D） 轉(zhuǎn)座元件插入（一般主要是長/短間隔序列元件LINE/SINE或者伴隨TEI相關(guān)事件 的兩者的組合）。結(jié)構(gòu)變異探測和擴(kuò)增子（Amplic

12、on ）的探測與識(shí)別分析：如下圖所示6. 測序深度分析測序深度分析就是指根據(jù)基因組框內(nèi)覆蓋度深度與期望覆蓋度深度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并識(shí)別出SV。我們也將采用不同算法識(shí)別原始測序數(shù)據(jù)中的缺失片段（deletion ）和重復(fù)片段（duplication ）。7. SV探測識(shí)別結(jié)果的整合與FDR推斷（可選步驟）（1）. PCR或者芯片方式驗(yàn)證 SV（2）.計(jì)算FDR-錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（配合驗(yàn)證試驗(yàn)由客戶指定）篩選SV檢出結(jié)果用于SV的合并和后續(xù)分析：我們通過不同方式探測識(shí)別SV的目的極大程度的檢出SV，并且降低其 FDR（ <=10% ）。通過下屬篩選方法決定后續(xù)分析所使用到的SV集合。每種SV探測識(shí)別算法

13、得到的SV的FDR要求小于10%，并將各自符合條件的SV合并；對(duì)于FDR大于10%的算法計(jì)算識(shí)別的 SV結(jié)果，如果有PCR和芯片平 臺(tái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，同樣可以納入后續(xù)SV分析中。最后，針對(duì)不同算法得到的SV，整合處理根據(jù)breakpoint斷點(diǎn)左右重合覆蓋度的置信區(qū)間來評(píng)定；8. 變異屬性分析（1） n eutral coalesce nt 分析測序數(shù)據(jù)可以探測到低頻率的變異體（MAF<=5% ）。根據(jù)來自群體遺傳學(xué)理論（neutralcoalesce nt理論）的期望值可以計(jì)算低頻度變異的分布。我們用不同等位基因頻率下每Mb變異數(shù)目與n eutral coalesce nt選擇下的期望值比值

14、，即每Mb基因組win dows內(nèi)的theta觀測值，來刻畫和反映自然純化選擇與種群（cancer cell-line可以特定的認(rèn)為是可以區(qū)分的種群）增長速率。該分布分別考察SNP （藍(lán)色線），In del （紅色線），具有基因型的大片段缺失（黑色線），以及外顯子區(qū)域上的SNP （綠色線）在不同等位基因頻率區(qū)間上的theta情況（參見下圖）。Variant allele frequency（2）.全新變異體（novel variant）的等位基因頻率和數(shù)量分布分析對(duì)象包括全新預(yù)測的SNP , in del , large deletio n,以及外顯子 SNP在每個(gè)等位基因頻率類別下的數(shù)目比率

15、（fraction ）（參見下圖）；全新預(yù)測是指預(yù)測分析結(jié)果與dbSNP （當(dāng)前版本129 ）以及deletion數(shù)據(jù)庫dbVar （ 2010年6月份版本）和已經(jīng)發(fā)表的有關(guān) in dels 研究的基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過比較后識(shí)別確定的全新的SNP，in del以及deletion。dbSNP包含SNP 和 in dels; dbVAR 包含有 deletio n, duplicatio n, 以及 mobile eleme nt in sertio n。dbRIP 以及其他基因組學(xué)研究（JC Ventrer以及Watson基因組，炎黃計(jì)劃亞洲人基因組）結(jié)果 提 供 的shortin dels禾口la

16、rgedeleti on。-®>oc upoelr6 4 2 o,a a0.0-0.0 0.2 04 0.6 0.8 1-0Variant allele frequency(3) .變異體的大小分布以及新穎性分布計(jì)算 SNP , Deletion，以及 Insertion 大小分布；計(jì)算 SNP , Deletion，以及 Insertion 中屬 于全新預(yù)測結(jié)果的數(shù)目占已有各自參考數(shù)據(jù)庫數(shù)目的比例(相對(duì)于dbSNP數(shù)據(jù)庫；dbSNP包含 SNP 和 indels;dbVAR 包含有 deletion,duplication, 以及 mobile element inserti

17、on。 dbRIP以及其他基因組學(xué)研究(JC Ventrer以及 Watson基因組，炎黃計(jì)劃亞洲人基因組)結(jié)果提供的short in dels和large deletion )其中，可以給出 LINE，Alu的特征位置。37G543?1O 匸也AQgain仝孑100kbkb “OtvipObp 10 kh3 2 10 o o o O6-ODeletionsSNPs Insartions<-og1D阿(4) .結(jié)構(gòu)變異SV的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)(BreakPoint Junction) 分析根據(jù)SV不同檢出結(jié)果經(jīng)過一些列篩選步驟構(gòu)建所有結(jié)構(gòu)變異SV的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，保留長度大于等于50bp的SV

18、 ;分析斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)處具有 homology或者microhomology的SV ； 并將同一染色體，起始和終止位置坐標(biāo)下的不同SV進(jìn)行去冗余處理。分析識(shí)別SV的斷點(diǎn)聯(lián)結(jié)點(diǎn)（Breakpoint）:將Breakpoint按照可能形成的方式可以分類為 以下幾類：（a） 非等位基因同源重組型（non-allelic homologous recombination-NAHR）;（b） 非同源重組 （non homologous recomb in atio n-NHR），包括 non homologous en d-jo ining （NHEJ）和 fork stalling /template s

19、witching （ FoSTeS/MMBIR ）；（c）可變串聯(lián)重復(fù)（VNTR）（d）轉(zhuǎn)座插入元件（TEI ）。313V512IInsertion traceFomwaiofi mechanism stacked hts-tognvnboogrannBMAHR DBNHR (3 TEIVWTR10飛圖CSV形成偏好性分析分析SV形成機(jī)制與斷裂點(diǎn)臨近區(qū)域序列的關(guān)系，包括染色質(zhì)界標(biāo)（端粒，中心粒），重組 高發(fā)熱點(diǎn)區(qū)域，重復(fù)序列以及GC含量，短DNA motif和微同源區(qū)域（microhomologyregion ）。D«tan» tQ lelomeFiM1,206a.e Oe

20、+O7 -C.Oa-i-OC-1 0fl+D8 rDtstsnce to eerrtncfnereeNAUR NHR TEIDe-tanw tn 窮用eny txwdwn1,2»+W-w-U NAH Fl NHR TEId.4.3 o ovlluQAA15co+ NHRBackground -p- Expectation0510152025Lenqfri ol microhomoloq (bp)9. 突變率估計(jì)針對(duì)以家庭成員為單位的測序方案，我們主要探測de novo的突變(DNM );通過采用不同的方法/算法，我們給出每個(gè)家庭一份推斷的DNM報(bào)表；(1) 根據(jù)基因型推斷結(jié)果，分別對(duì)

21、每人每堿基位置上的de novo突變進(jìn)行綜合度量;(2) 采用貝葉斯方法計(jì)算家庭組設(shè)計(jì)中DNM的后驗(yàn)概率10. SNP，SNV功能分析與注釋(1).祖先等位基因的注釋通過將人類(NCBI36)，黑猩猩(chimpanzee2.1 )，猩猩(PPYG2)以及恒河猴(MMUL1) 4種基因組進(jìn)行基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)保守的序列區(qū)域，計(jì)算祖先等位基因；以及 duplicatio n/deleti on 事件的進(jìn)化分析。(2).分析基因結(jié)構(gòu)序列上不同區(qū)域的多樣性( Diversity )與分歧進(jìn)化(diverge nee )根據(jù)基因型分析結(jié)果計(jì)算基因結(jié)構(gòu)序列上的多樣性程度，即雜合度(heterozygosi

22、ty);雜合度指標(biāo)可以說明選擇效應(yīng)的存在以及局部變異的結(jié)構(gòu)分布特征模式。我們將考慮基因5' UTR上游200bp，5' UTR，第一個(gè)外顯子，第一個(gè)內(nèi)含子，中間外顯子，中間內(nèi)含子，最末外顯子和內(nèi)含子，以及 3' UTR及其下游200bp區(qū)域左右考察的范圍(參見下圖a)。分析編碼 轉(zhuǎn)錄本的起始/終止位置臨近區(qū)域的多樣性和進(jìn)化分歧度(參見下圖 b)。0.UU120.00060.0000Jd0.016-0.012'0 008-0.4 -0.2 0.0 0.2 04cM from transcription start/stop(3).疾病變異體探測將樣本測序中分析得到

23、 SV與HGMD疾病變異體數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到交叉記錄的錯(cuò)義和無 義的SNP ;通過將HGMD疾病關(guān)聯(lián)突變與 CUI (疾病概念分類標(biāo)識(shí)數(shù)據(jù)庫) 比對(duì)獲得HGMD 中所有SV的疾病表型，并獲得HGMD與測序數(shù)據(jù)分析得到的 SV的疾病表型；并通過Fisher 檢驗(yàn)和Bonferroni多重假設(shè)檢驗(yàn)校正計(jì)算樣本SV所富集的疾病表型。pHddw(4).拷貝數(shù)變異CNV所含基因的功能注釋將CNV是否覆蓋區(qū)段重復(fù) SD區(qū)域分類為2大類, 計(jì)算，顯著性在橫軸表示；各種顯著性功能在縱軸表示。每類CNV的所含基因的功能富集情況CAH/l iwi tswrbppmg 5Ca如屮沖呂站-LogJPrthjPi0E初

24、PmiMHMftBM(5) .變異的功能性分析與注釋(a) . SNP, Indels以及大的結(jié)構(gòu)變異 SV的功能注釋；(b) .對(duì)包含翻譯起始注釋信息的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)上的SNP分類為：同義SNP ,非同義SNP 和無義SNP (引入終止子)，干擾終止子的 SNP，以及干擾剪接位點(diǎn)的 SNP ;為了降低假 陽性，我們采用嚴(yán)格的篩選方式過濾來自 in dels的錯(cuò)誤；(c) 對(duì)錯(cuò)義編碼區(qū)突變的功能性分析：通過信息學(xué)分析算法評(píng)估相對(duì)于生殖系變異的體細(xì) 胞突變對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響效應(yīng)。(6). SNV，SNP與miRNA研究之間的關(guān)聯(lián)分析miRNA是起重要的調(diào)控作用的小分子，我們將對(duì)miRNA的

25、pri-mRNA ，pre-miRNA 以及miRNA靶基因序列進(jìn)行分析，識(shí)別潛在的SNP功能位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)研究提供證據(jù)表明Humanpre-miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在不同位置上的SNP，我們將通過熱力學(xué)穩(wěn)定性分析方法評(píng)估SNP對(duì)pre-miRNA結(jié)構(gòu)的影響；另外，我們也將對(duì)miRNA-Target靶基因相互作用位點(diǎn)做分析，評(píng)估對(duì)SNP對(duì)靶基因靶向性的影響。MIR*19MIR(7). SNV，SNP與GWAS研究之間的關(guān)聯(lián)分析分析GWAS研究中得到的易感基因在基因組上不同坐標(biāo)上的OR值分布情況；將當(dāng)前已知的GWAS研究成果與SNP進(jìn)行比較；根據(jù) LD連鎖不平衡將SNP與易感基因的關(guān)系進(jìn) 行深入討

26、論；直接與間接關(guān)聯(lián)方法可以分別識(shí)別與表型相關(guān)的SNP，對(duì)于不易獲得(missing)和定位的SNP，通過LD連鎖不平衡推斷疾病易感基因突變座位。(8)生物學(xué)通路(代謝通路，信號(hào)通路)分析生物學(xué)通路(Biological pathway )，包括代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物功能的重要組成 部分，我們將各種形式的突變、變異，包括SNV和SNP，的對(duì)應(yīng)基因放到生物學(xué)通路中進(jìn)行綜合分析，考察功能性突變對(duì)pathway的影響程度和影響的規(guī)律。通過GSEA (配合芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù))，KS檢驗(yàn)，超幾何分布檢驗(yàn)等方法對(duì)變異基因在某些pathway的富集程度進(jìn)行排序，識(shí)別發(fā)生功能改變的潛在通路。(9).蛋白質(zhì)-蛋

27、白質(zhì)相互作用(PPI )網(wǎng)絡(luò)分析蛋白質(zhì)相互作用也是生物分子功能增益和缺失的重要途徑，因此我們針對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的突變的蛋白及其收到影響的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析，并對(duì)收到影響的網(wǎng)絡(luò)子結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能注釋分析和聚類富分析。我們采用網(wǎng)絡(luò)分析算法對(duì)由于各種突變所受到影響的子網(wǎng) 絡(luò)(sub network )進(jìn)行功能富集度的分析；3(10).順式基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模塊(CRM )分析(a) 啟動(dòng)子序列分析包括動(dòng)子區(qū)域上的 Motif預(yù)測，并與已知轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 TRANSFAC和JASPAR中的TFBS 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)；啟動(dòng)子區(qū)域上保守性分析，分析突變位置和保守性區(qū)域的關(guān)聯(lián)；(b) 計(jì)算全基因組保守性。

28、確定TFBS的保守性以及 mutation位置的保守性；(11 )重排(arrangements )與突變(mutation )的全基因組統(tǒng)計(jì)(a) .體細(xì)胞(somatic)和生殖系(germline )重排(arrangements )體細(xì)胞突變是相對(duì)于germ line突變的一類需要重要分析的內(nèi)容，我們針對(duì)Case-control設(shè)計(jì)的測序方案可以分別分析突變的情況，包括SNV , in del，以及 CNV ;如果僅在tumor/disease(Case 組)出現(xiàn)而不在normal (對(duì)照組)出現(xiàn)的突變我們可以認(rèn)為是somatic體細(xì)胞突變。將somatic mutation 與dbS

29、NP數(shù)據(jù)庫比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)潛在的全新的突變和有記 錄的突變位置。然后，將突變分別比對(duì)到基因區(qū)域和非基因區(qū)域?；騾^(qū)域具體包括：內(nèi)含子區(qū)，UTR，剪接位點(diǎn)區(qū)和外顯子區(qū)。其中外顯子區(qū)分別統(tǒng)計(jì)：同義(synonymous )，缺失(deletion ),閱讀框移位 (frameshift )，插入(insertion )，錯(cuò)義(missense ),無義(nonsense ) 以及非編碼蛋白外顯子 (non-protein coding exon)等不同類型。綜合不同方面分析的結(jié)果，并按照突變分類給出各重排（arrangements）類型：SNV , CNV的數(shù)目統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表（參見下圖）。對(duì)每一測序樣本分別進(jìn)行標(biāo)注，包括體細(xì)胞突