植物生理生化指標(biāo)測(cè)定精

1、小黑豆相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定1. 表型變化：鮮重、株高、主根長(zhǎng)和葉面積鮮重：取處理好的植株,擦干根和葉表面水分，測(cè)量整株植物的重量，每個(gè)測(cè)6個(gè) 重復(fù)。株高：取處理好的植株，測(cè)量從根和莖分隔處到植株最高點(diǎn)的高度，記錄，每個(gè)測(cè) 6個(gè)重復(fù)。主根長(zhǎng)：取處理好的植株，測(cè)量從根和莖分隔處到主根最遠(yuǎn)點(diǎn)長(zhǎng)度，記錄，每個(gè)測(cè) 6個(gè)重復(fù)。葉面積：取處理好的植株，選擇第二節(jié)段的葉片，測(cè)量葉面積，葉面積測(cè)量方法是 測(cè)每個(gè)葉片最寬處長(zhǎng)度作為葉的長(zhǎng)，測(cè)葉片最窄處長(zhǎng)度作為葉的寬，葉片長(zhǎng)和寬的 乘積即為葉表面積。每個(gè)測(cè)6個(gè)重復(fù)。2. 總蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA和H2O2含量測(cè)定樣品處理:取0.5g樣品（葉片要去除葉脈、根要先用

2、清水清洗干凈，速在液氮中 凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCI （pH7.4抽提，將抽提液 轉(zhuǎn)移到2ml的EP管中,于4C, 12000rpm離心15min ,取上清,保存在-20C下，上清 液可用于總蛋白、丙二醛（MDA、可溶性糖和H2O2含量測(cè)定。總蛋白測(cè)定（Bradford法：樣品反應(yīng)體系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul樣品， 空白對(duì)照為（800ul H2O+200ul Bradford。測(cè)定后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線丫=32.549X- 0.224（Y代表蛋白含量,X代表OD595，計(jì)算得出蛋白含量。可溶性糖測(cè)定：樣品反應(yīng)體系（1ml蒽酮+

3、180ul ddH2O+20ul樣品提取液；空白 對(duì)照（1ml蒽酮+180ul ddH2O ,測(cè)定OD625后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線： Y=0.0345X+0.0204（Y代表OD625, X代表可溶性糖含量（ug蒽酮配方：稱取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml濃硫酸+30mlH2O .注意： 濃硫酸加入水中時(shí)，一點(diǎn)一點(diǎn)遞加，小心濺出受傷。丙二醛（MDA測(cè)定:在酸性和高溫條件下,丙二醛可與硫代巴比妥（TBA反應(yīng)生 成紅棕色的3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮，在532nm處有最大吸收波長(zhǎng)，但該反應(yīng)受可 溶性糖的極大干擾，糖與TBA的反應(yīng)產(chǎn)物在532nm處也有吸收，但其最大吸收波長(zhǎng) 在450nm

4、處。采用雙組分分光光度法，可計(jì)算出MDA含量。MDA的計(jì)算公式 為:MDA （umol/L =6.45OD532-0.56OD450.反應(yīng)體系為:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul 樣品，80C水浴 10min 后，測(cè) OD532 和 OD450。對(duì)照用 Tris-HCl.0.6%TBA配方:稱取硫代巴比妥0.6g溶于少量1M NaOH中，待其完全 溶解后 用10%TCA（稱取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸餾水中，待其溶解 即可定容至 100ml。H2O2測(cè)定（二甲酚橙法：樣品反應(yīng)體系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10 +150ul樣品提取液,

5、30E水浴30min，測(cè)OD560。標(biāo)準(zhǔn)曲線 為:丫=0.01734X- 0.0555（Y 代表 OD560, X 代表 H2O2 含量溶液 A （200ml :FeSO4.7H2O 0.1835g; （NH42SO4 0.0872g; H2SO4濃硫酸 18M4.58ml ,加水定容。溶液B （200ml :二甲酚橙0.0234g 山梨醇6g加水定容到200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD和CAT活性測(cè)定樣品處理:取0.5g樣品,速在液氮中凍存，在遇冷的研缽中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl （pH7.0 （內(nèi)含有 20%甘油、1mmol/L ASA（抗壞血 酸、1m

6、mol/L DTT（二硫蘇糖醇、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH（還原型谷胱甘肽、5mmol/L MgCl2抽提，將抽提液轉(zhuǎn)移到2ml的EP管中，于4C , 12000rpm離心15min ,取上清, 保存在-20r下,上清液可用于可溶性蛋白、SOD、POD和CAT含量測(cè)定。1mmol/L的ASA配制:先配制10mmol/L的母液一稱取176.13mg的ASA ,溶于 100ml的Tris-HCI （pH7.0中即可，然后稀釋10倍即可。1mmoI/L的DTT配制:先配制10mmol/L的母液一稱取154.25mg的DDT溶于 100 ml的Tris-HCl （pH7.0中即可

7、，然后稀釋10倍即可。1mmol/L 的 EDTA 配制:用 30mmol/L 的 EDTA 稀釋 30倍即可。5mmol/L 的 MgCI2 配制:稱取 MgCI2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl(pH7.0，即可。樣品提取液的配制（200ml :取10mmol/L的ASA母液20ml , 10mmol/L的母液DTT20ml ,取 30mmol/L 的 EDTA 母液 7ml ,稱取 203mg 的 MgCI2.6H2O ,最后再量 取20ml的甘油，將最終體積定容到200ml，即可。可溶性蛋白測(cè)定（Bradford法:樣品反應(yīng)體系（800ul H2O

8、+200uIBradford+5ul樣品，空白對(duì)照為（800ul H2O+200uI Bradford。測(cè)定后帶入標(biāo)準(zhǔn) 曲線 丫=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量,X代表OD595，計(jì)算得出蛋白含量。SOD測(cè)定:SOD活性的測(cè)定是根據(jù)照光時(shí)，體系中產(chǎn)生氧自由基使硝基四 唑藍(lán) 還原成藍(lán)色甲（在 560nm處有一吸收峰，而超氧化物歧化酶作為氧自由基 的清除劑 可抑制此反應(yīng)。？ 一個(gè)酶活單位定義為將硝基四唑藍(lán)的還原抑制到對(duì)照一半（50% 時(shí)所需的酶量。14.5mmoI/L的dl-甲硫氨酸（分子量149.21 （現(xiàn)用現(xiàn)配：稱取甲硫氨酸216.4mg , 加少量Tris-HCI（pH7.0溶解

9、后,用Tris-HCI（pH7.0定容到100ml，即 可。30mmoI/L的EDTA （292.25 （現(xiàn)用現(xiàn)配：稱取EDTA藥品876.75mg力卩少量Tris-HCI（pH7.0 溶解后，用 Tris-HCI（pH7.0 定容到 100ml ,即可。2.25mmoI/L的NBT （硝基四唑藍(lán)（817.6 （現(xiàn)用現(xiàn)配：稱取NBT藥品183.96mg ,加少量Tris-HCI（pH7.0溶解后,用Tris-HCI（pH7.0定容到100ml，即 可60umol/L的核黃素（376.36現(xiàn)用現(xiàn)配：先稱取225.81mg的核黃素,加少量50mM Tris-HCI（pH7.4 溶解后,用 50mM

10、 Tris-HCI（pH7.4 定容到 10ml ,配制成 60mmoI/L的母液 然后取100ul到100ml的Tris-HCl（pH7.4中，即可配制成60umol/L 的核黃素。測(cè)酶活的反應(yīng)介質(zhì)：測(cè)定前在54ml的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分別加 入 EDTA、NBT和核黃素各2ml ,此為反應(yīng)混合液。酶活測(cè)定:在盛有1.0ml反應(yīng)液的試管中,加入適量的酶液（50ul （以抑制達(dá)50% 作用酶濃度為最佳?；靹蚝蠓旁谕该鞯脑嚬芗苌?，于光照培養(yǎng)箱中準(zhǔn) 確照光10min 后，迅速測(cè)定560nm處的光密度。以不加酶液照光液的為對(duì)照，計(jì)算反應(yīng)被抑制的 百分比。按下式計(jì)算超氧化物歧化酶的

11、活性 A N酶活力=AOK W XT >V >50%式中:酶活力單位為每min每g鮮重酶活單位數(shù)；AO為對(duì)照試管溶液在560nm處的吸光度值； A為對(duì)照試管溶液在560nm處的吸光值與加入酶液的反應(yīng)液在 560nm處 的吸光值的差；N為酶液總體積；W為提取酶液的樣品鮮重g ; T為照光時(shí)間（10min; V為加入酶液的體積（ml;POD測(cè)定（愈創(chuàng)木酚法：過氧化物酶廣泛分布于植物的各個(gè)組織器官中。 在有 過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì) 測(cè)量生成物的含量。反應(yīng)混合液配制：在50ml的50mmol/L的Tris-HCI(pH7.0緩沖液中加入2

12、8ul的 愈創(chuàng)木酚，與磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酚溶解，再加入19ul的30%的H2O2, 混合均勻，4C保存。酶活測(cè)定:取反應(yīng)混合液1.0ml ,加入0.1ml酶提取液，2min前后，于470nm處測(cè) OD值，每隔1min讀數(shù)一次，以每分鐘OD值的變化表示酶活大小。(測(cè)量時(shí)再加入 酶液CAT測(cè)定(H2O2法反應(yīng)緩沖液:20mM的H2O2,使用前在25C水浴中加熱30min。酶活測(cè)定:取反應(yīng)液1.4ml，加入100ul酶液,每加完一管立即計(jì)時(shí)，并迅速在波長(zhǎng) 240nm下測(cè)定30S、1min30S、2min30S時(shí)的吸光度，以Tris-HCl的作為空白。以 1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位。代入酶活力公式,以 OD*V/0.1*v*t FW 表示CAT活性,所有測(cè)定均重復(fù)三次。 OD代表空白的吸光度-樣品管的吸光度；V代表酶提取液的總體積，v代表測(cè)量是加入的樣 品體積;t代 表反應(yīng)時(shí)間min , FW代表樣品鮮重。0.1mol/LH2O2 配方:稱取 1.1333g 的 30%的 H2O2,加入 100ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCl(pH7.4,即可。也可以用 0.01%的 H2O2。4