71無菌檢查法

1、V 71 無菌檢查（USP29-NF24）這個章節(jié)的大部分內(nèi)容都和歐洲藥典或日本藥典相應檢測部分保持一致。有一些不一致的地方已用特殊標記（.）注明。下述步驟被用于檢查藥典中規(guī)定要求無菌的是否滿足其專論中相應的無菌要求。供試品的性狀允許時，可以采用供試品的無菌檢查中的薄膜過濾法來檢測。如果薄膜過濾方法不能 使用，貝慄用供試品的無菌檢查中的直接接種法進行檢測。所有的器具，除了標明的無菌器 皿外，都采用 直接接種法進行檢測。重新檢測的規(guī)定條款見 結(jié)果的觀測和分析。因為無菌檢測是一項非常嚴格的操作過程（必須保證無菌操作才能得到一個準確的檢測結(jié)果），所以對操作人員進行相關(guān)的培訓和鑒定是非常重要的。無菌檢

2、查即在無菌狀態(tài)下實 行。為了達到這個狀態(tài)， 檢測的環(huán)境必須適合無菌操作。要防止檢驗過程中暴露的微生物受污染。要對無菌檢驗的操作環(huán)境進行適當?shù)厝訖z測和合適的控制來監(jiān)控。不僅僅通過這些藥典中的步驟就能確保一批產(chǎn)品無菌或已經(jīng)滅菌。確認在無菌狀態(tài)下操作或按無菌操作步驟操作則是首先需要的。當用藥典中合適的藥典方法檢測產(chǎn)品中出現(xiàn)了微生物污染，其結(jié)果宣判該無菌檢測所需方法無效，甚至是更換了操作步驟得到了不同的結(jié)果。額外的無菌檢測信息，參見 V 1211滅菌和確保無菌概略培養(yǎng)基按以下處方制備培養(yǎng)基，或使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基，其能滿足需氣 菌，厭氣菌，霉菌的增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用有效的程序滅菌。

3、下面培養(yǎng)基適合用于無菌檢查。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氣菌的培養(yǎng)。還用于需氣菌的培養(yǎng)。大豆粉-酪蛋白消化物培養(yǎng)基 適合霉菌和需氣菌的培養(yǎng)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基L-光胺酸2.5g氯化鈉5.5g/5.0g葡萄糖(C6H12O6.H2O)0.75g瓊脂，顆粒狀（含水量不低于15%）5.0g酵母浸出物（可溶于水）15.0g酪蛋白胰酶消化物0.5g巰基乙酸鈉或巰基乙酸酯0.3ml刃天青鈉溶液（1 : 1000），現(xiàn)配1.0ml純水1000ml取L-光胺酸，氯化鈉，葡萄糖，酵母浸出物和酪蛋白胰酶消化物混合，加熱直到培養(yǎng)基被活化。加入巰基乙酸鈉或巰基乙酸酯，如有必要，加1N氫氧化鈉，調(diào)節(jié) PH值使滅菌

4、后為7.1 ± 0.2。如需過濾，加熱培養(yǎng)基不需要煮沸，熱時濾過濾紙。加入刃天青鈉溶液,混合，馬上分裝至合適容器中，這樣在培養(yǎng)期間最多培養(yǎng)上層基顏色發(fā)生變化。配制后采用有效的程序滅菌，培養(yǎng)基放于無菌密閉容器中，2。25°儲存，如果上層超過三分之一的培養(yǎng)基變粉紅色 ，培養(yǎng)基需水浴或蒸汽加熱直到粉紅色消失，迅速冷卻，注意防止沒有滅 菌的空氣傳入容器中。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 置32.5° ± 2.5°培養(yǎng)。選擇性硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基配制與硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基相同組分的培養(yǎng)基，但不加瓊脂和刃天青鈉溶液，滅菌同 上，冷卻。滅菌后 PH7.1 ± 0

5、.2。在厭氧條件下培養(yǎng)。選擇性硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基 置32.5° 土 2.5°培養(yǎng)。大豆粉-酪蛋白消化物培養(yǎng)基酪蛋白胰酶消化物17.0g大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖(C6H12O6.H2O)2.5/2.3g純水1000ml在純水中溶解固體，微溫加熱活化培養(yǎng)基。培養(yǎng)基冷至室溫，加1N氫氧化鈉調(diào)PH,調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.3± 0.2。濾清，然后分裝入合適的容器，除非需要馬上使用，放于 無菌密閉容器中，2°25 °儲存。青霉素和頭孢菌素在這無菌檢測培養(yǎng)基被用于 供試品的無菌檢查中直接接種法，修改硫乙醇酸鹽流體培

6、養(yǎng) 基和大豆粉-酪蛋白消化物培養(yǎng)基 的配制如下。無菌狀態(tài)下在每個培養(yǎng)基容器中接種足夠數(shù) 量的3 -內(nèi)酰胺酶以抑制供試品中大量抗生素的活性，首先通過檢驗產(chǎn)品中含青霉素或頭孢 菌素的抑菌活力以測定所需要的抑制抗生素活性的3 -內(nèi)酰胺酶數(shù)量。筆記一充足的3 -內(nèi)酰胺酶培養(yǎng)基也可用于薄膜過濾測試。在一個與無菌檢測完全隔離的區(qū)域，確定合適數(shù)量的3 -內(nèi)酰胺酶合并接種至培養(yǎng)基中，選擇下面驗證試驗中任一種方法，用不到100cfu的金黃色葡萄球菌（參見表格1）做為挑戰(zhàn)。 必須可清楚觀察到被接種的培養(yǎng)基中有典型的微生物生長，用以確定3 -內(nèi)酰胺酶的含量是 合適的。10表格1.增殖檢測和驗證試驗中適合使用的微生物

7、菌株好氧菌金黃色葡萄菌1 ATCC6538, CIP4.83,NCTC10788,NCIMB9518大腸菌群ATCC6633, CIP52.62, NCIMB8054銅綠假單胞菌2 ATCC9027, NCTC10788, CIP82.118厭氧菌生抱梭菌ATCC19404 , CIP79.3,NCTC532 或 ATCC11437霉菌假絲酵母ATCC10231,IP48.72,NCPF3179黑曲霉ATCC16404,IP1431.83,IMI149007 1用大腸埃希菌代替金黃色萄葡球菌（ATCC6633） 2用藤黃微球菌（）代替生抱梭菌（ATCC9341 ）3用不產(chǎn)孢子的代替銅綠假單胞菌

8、 （ATCC8482 ）筆記-使用菌種培養(yǎng)保藏技術(shù)（菌種系統(tǒng)），使得用于接種的活性微生物由原來主要的菌種被轉(zhuǎn)種不超過5代。適用性檢查本檢查可在產(chǎn)品的無菌檢查前或與產(chǎn)品的無菌檢查同時進行。無菌性確定每批無菌培養(yǎng)基無菌，取一定量培養(yǎng)基在特定的溫度下培養(yǎng)14天。應無菌生長。好氧菌，厭氧菌和霉菌的增殖檢測檢測每批配置好的培養(yǎng)基，無論是脫水培養(yǎng)基還是按成分配制1。合適的微生物菌株在表格1中說明。接種小于100cfu生抱梭菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)。接種小于100cfu生抱梭菌培養(yǎng)物至選擇性硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別接種 小于100cfu的黑曲霉，枯草桿菌和假絲酵母于

9、大豆粉-酪蛋白消化物培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細菌培 養(yǎng)不超過3天，霉菌培養(yǎng)不超過 5天。如果可清楚地觀察到有菌生長，培養(yǎng)基符合規(guī)定。儲存如果配好的培養(yǎng)基保存于非密閉容器中，一般在1個月內(nèi)使用，提供了兩周內(nèi)培養(yǎng)基增殖檢測和顏色符合規(guī)定的檢測。如果保存在密閉容器中， 一般可在1年內(nèi)使用，提供了三個月內(nèi)培養(yǎng)基增殖檢測和顏色符合規(guī)定的檢測。薄膜過濾法的稀釋液、沖洗液稀釋液A配制取1g動物組織胃蛋白酶消化物，加水1L,過濾或離心至澄清，如果必要，調(diào)節(jié)PH至7.1 ± 0.2。分裝到容器中，采用驗證合格的滅菌程序進行滅菌。青霉素和頭孢菌素的配制如有必要，在溶解的供試品過濾后，在無菌狀態(tài)下添加一些無菌的3

10、-內(nèi)酰胺酶到上述準備好的培養(yǎng)基中，足以消除膜上殘余任何抗生素的抑菌活性，（參見青霉素和頭抱菌素培養(yǎng)基丿。稀釋液D每1L洗液A加1ml聚山梨酯80,調(diào)PH至7.1 ± 0.2，分裝在容器中，采用有效的程序 滅菌。這個稀洗液用于含有卵磷酯或油的物品，或標有“無菌標簽”的設備。稀釋液K取5g動物組織胃蛋白酶消化物，3.0g牛肉浸出物，10.0g聚山梨酯80混合溶于水中,加水稀釋至1000ml。調(diào)節(jié)使滅菌后 PH為6.9 ± 0.2。分裝到容器中，采用有效的程序滅菌。驗證試驗按產(chǎn)品的無菌檢測法同樣的方法進行檢測，除了下面的修改。薄膜過濾法在添加要檢測的容器中的樣品至薄膜之后，在最后

11、一次用于沖洗濾器的無菌沖洗液中 加入一定量合適的微生物（不超過100cfu ）。直接接種法把要檢測容器中樣品（用于腸線和其它獸醫(yī)用的外科縫合線）加至增菌培養(yǎng)基之后，加入一定量合適的微生物（不超過100cfu ）到培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在兩種情況下，用與需氣菌，厭氣菌和霉菌的增殖檢測相同的微生物。制定一個增殖檢測做陽性控制。所有含培養(yǎng)基的培養(yǎng) 物，培養(yǎng)不到5天。通常對照沒有產(chǎn)品的控制容器，如果培養(yǎng)后可清楚地觀察到有菌生長， 要么產(chǎn)品在該檢驗條件下不含有抑菌活性，要么這種抑菌活性被完全限制。不用進一步修改就可以進行無菌檢查。如果在產(chǎn)品檢測過程中沒有清楚地觀察到有菌生長，通常對照沒有產(chǎn)品的控制容器，產(chǎn)品的在

12、此檢驗條件下抑菌活性沒有被完全消除。為了消除供試品的抑菌活性，修改條件，并重新進行 驗證試驗。當（a）新產(chǎn)品需要無菌檢測和（b）檢測的實驗條件 發(fā)生改變時，需要進行驗證試驗。驗證試驗可以和 供試品的無菌檢查 同時進行。供試品的無菌檢查樣品的檢驗數(shù)量除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種被檢品的量按 表3所示。如果每只供試品的裝量足夠 （參 見表2）,等量加到專用培養(yǎng)基中。筆記-配制無菌實驗用的兩種或多種培養(yǎng)基。 如果每種 培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量不足，按表格3所示數(shù)量的兩倍。表2.每瓶樣品接入每種培養(yǎng)基的最少樣品量每瓶含量最少檢驗數(shù)量（除非另有規(guī)定）液體制劑（不含抗生素 ）v 1ml全量1ml40ml半量，但

13、1ml40ml100ml20ml> 100ml取全量的10%，但20ml抗生素液體制劑1ml可溶于水或異丙基十四烷酸鹽的供試品全量，但200mg混懸或乳化的乳膏，藥膏> 200mg固體制劑v 50mg全量50mg300mg半量，但50mg300mg5g150mg> 5g500mg器具腸線和其它獸醫(yī)用外科縫合線一根三段（每根 30cm）外科用敷料/棉花/紗布（成包）每包100mg縫合線和其它個別的包扎好單獨用的東西整個材料其它醫(yī)用器具整個器具，切碎或拆散開表3.與批產(chǎn)品的數(shù)量相比產(chǎn)品最少檢驗數(shù)量批產(chǎn)品的量用于每種培養(yǎng)基的產(chǎn)品 最小檢驗數(shù)量非腸道制劑< 10010 %或4個

14、（取較多者）100v N < 500 瓶10個> 500 瓶2 %或20個（取較少者）大容量非腸道制劑2 %或10個（取較少者）抗生素固體制劑配藥散裝包裝（v 5g20瓶配藥散裝包裝（5g）6瓶散裝劑和混合劑參見桶裝固體制劑眼用或其它非注射用制劑< 200 瓶5 %或2瓶（取較多者）> 200 瓶10瓶單劑量產(chǎn)品提供產(chǎn)品非腸道用記錄器具腸線和其它獸醫(yī)用外科縫合線2%或 5 件（W 20）< 100 件10%或4件（取較多者）100v N < 50010件> 500 件2%或20件（取較少者）桶裝固體制劑4桶每桶4v N < 5020%或4桶（取較

15、多者）> 50桶2 %或10桶（取較多者）如果每瓶樣品的裝量按規(guī)定足夠接種兩個培養(yǎng)基，則由這個裝量來確定所 有培養(yǎng)基需要的樣品的量。用薄膜過濾法或直接接種法進行檢測。包括合適的陰性控制。 供試品性狀允許時用薄膜 過濾方法；就是說，用于過濾水溶性供試品，酒精供試品或油劑供試品和易混合的供試品。 可溶于水或油的供試品。這些溶劑在檢驗中沒有抑菌活性。薄膜過濾法濾膜表面孔徑不大于 0.45um，其作用是過濾截住微生物。例如，硝酸纖維素濾膜，用 于高濃度酒精溶劑。有的產(chǎn)品需要專門合適的濾膜（例如，抗生素）。下面方法所用濾膜大約直徑50mm。如果使用不同直徑的濾膜，稀釋量和沖洗量都應相應調(diào)整。濾器和

16、濾膜用適宜的方法滅菌。過濾器的容量一定，并且濾膜無菌：它允許膜無 菌移動以改變培養(yǎng)基，并且過濾器可以加入培養(yǎng)基然后倒掉。水溶液供試品如果適當?shù)?，加少量合適的無菌沖洗液稀釋液A （參見薄膜過濾稀釋液和沖洗液）到濾器的濾膜上然后過濾，沖洗液可含有合適的中和劑和 /或適當?shù)臏缁顒?，例如，為了?免抗生素。添加樣品到膜上，如果必要，用驗證試驗規(guī)定量的無菌沖洗液沖洗，但不少于表 2和表3中檢驗產(chǎn)品的數(shù)量。立即過濾。如果產(chǎn)品有抑菌，每次沖洗濾膜的量不少于驗證試驗用量的3倍。不需要每次 200ml沖洗5遍，盡管在驗證中證明這個量不能完全消除抗菌 活性。把整片薄膜加到培養(yǎng)基上或無菌條件下平分，再把兩瓣分別加到

17、兩個培養(yǎng)基中。用與驗證試驗中相同量的各種培養(yǎng)基。反過來，也可加培養(yǎng)基到過濾器膜上。培養(yǎng)基的培養(yǎng)不少于14天。可溶于水的固體制劑（不包括抗生素）每種培養(yǎng)基中供試品量不少于 表2和表3所示，溶解于合適的沖洗液中，例如稀釋液A （參見薄膜過濾稀釋液和沖洗液）用密封式薄膜過濾器過濾，然后按上述水溶液供試品 項下的方法操作。油類和油劑供試品每種培養(yǎng)基中供試品加入量不少于表2和表3所示。完全低粘性的油類和油的溶液可以不用沖洗液而用干膜過濾。粘性油劑可用合適的無菌稀釋液如沒有抑菌活性的十四烷酸異 丙酯溶解。讓油靠重量滲透膜， 施加壓力或逐漸的吸力過濾。 適用性檢查中用合適的無菌稀 釋液，如加稀釋液A （參見

18、薄膜過濾稀釋液和沖洗液）含有濃度為10 g /L的乳化劑吐溫 80 （稀釋液K）沖洗薄膜，每次100ml至少沖洗3遍。把濾膜加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按上述按 水溶液供試品項下的方法操作，并且培養(yǎng)的溫度和時間都相同。油膏劑和乳劑每種培養(yǎng)基中供試品加入量不少于 表2和表3所示。脂肪型的油膏劑和水油型乳劑可以 用上述的十四烷酸異丙酯稀釋至1%,如有必要，低于40C微溫加熱。個別情況不超過44C。馬上過濾，檢測步驟如上 油類和油劑供試品檢查所述。預先裝滿的注射器對于預先裝滿的注射器，排出每個注射器中樣品到一個或兩個單獨的薄膜過濾器中或添 加前先合并到單獨的容器中。若附有單獨的無菌的針頭，同上直接排出注射器中

19、樣品，然后 按水溶液供試品項下方法操作。用直接接種法檢測針頭的無菌性。注射用非抗生素固體制劑供試品按表格中所述混合檢測樣品，按 油類和油劑供試品項下方法操作。筆記-如果必要， 沖洗液可被加到混合物中幫助過濾混合的檢測樣品。注射用抗生素固體制劑配藥散裝包裝，v 5g 從20個瓶中取，無菌條件下取300mg固體加到500ml錐形瓶 中，加200ml稀釋液A （參見薄膜過濾稀釋液和沖洗液）溶解，混合；或按表格所制定量， 20個瓶中各加一定量的稀釋液或懸浮液，含有大約300mg的固體，加入500ml錐形瓶中，200ml稀釋液A溶解，混合。按水溶液供試品或油類和油劑供試品項下方法操作。配藥散裝包裝， 5

20、g從6個瓶中取，無菌條件下取300mg固體加到500ml錐形瓶中， 200ml稀釋液A溶解，混合；或按表格所示量制定，每6個供試品加一定量洗液，含有大約1的g固體，加到500ml錐形瓶中，200ml稀釋液A溶解，混合。按 水溶液供試品項下方法 操作。抗生素固體制劑，散裝劑，混合劑無菌條件下從瓶中取足夠用的固體制劑（參見表2）,混合后大約6g,加入500ml錐形瓶中。200ml稀釋液A溶解，混合。按水溶液供試品項下方法操作。無菌氣霧劑供試品將密封氣霧劑中液體供試品置酒精干冰室-20 C冷凍1h。如果方便，無菌條件下容器開啟前釋放拋射劑，把供試品加入無菌錐形瓶中。加100ml稀釋液D，慢慢攪拌。按

21、 油類和油劑供試品項下方法操作。標有滅菌標志的器具無菌條件下用不少于10個導管用量的稀釋液D沖洗每個導管。把洗液合并加入無菌瓶中，按油類和油劑供試品項下方法操作。直接接種法將一定量表2和表3中所示量的供試品直接加到培養(yǎng)基中，除非另有規(guī)定，供試品的 量不多于培養(yǎng)基量的 10%。如果供試品有抑菌活性，加入合適的中和劑或使用足夠量的培養(yǎng)基以消除抑菌活性。當需要用供試品的量比較大時，可以根據(jù)后來的沖洗液選擇使用一定濃度培養(yǎng)基。合適濃度的培養(yǎng)基可直接加到供試品容器中。黏性油劑供試品適用性檢查中，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的乳化劑，例如0.1%吐溫80。油膏劑和乳劑在無菌稀釋液A （參見薄膜過濾稀釋液和沖洗液

22、）中加入1/10的乳化劑，不含乳化劑 的沖洗過的供試品加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至少14天。培養(yǎng)期間逐日觀察培養(yǎng)基。每天輕輕搖晃培養(yǎng)基中黏油性供試品。 然而，當硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基合其它相似培養(yǎng)基用于檢查厭氧菌時， 避免振蕩或混合以保持厭氧菌的性狀。腸線和其它獸醫(yī)用外科縫合線將一定量不少于表 2和表3中所示量的供試品直接加到培養(yǎng)基中。無菌拆開包裝，每個培養(yǎng)基中加入3段。切成開頭，中間，末尾 3段，每段30cm長。從已打開的盒包裝中取一 整段。每段加入選擇性培養(yǎng)基中。使用的培養(yǎng)基足以浸沒供試品（加20ml供試品到150ml培養(yǎng)基中）。固體制劑干的固體制劑供試品（或準備加了無菌洗液的供試品懸浮液），不少于 表2和表3中所 示的供試品的量，加到 200ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，混合。同樣的，加相同數(shù)量供試 品到大豆粉-酪蛋白消化物培養(yǎng)基中，混合。檢查同上。外科用敷料，棉花，紗布，和有關(guān)的供試品無菌條件下，從棉線，紗布，或大的外敷料中間部分按100mg至500mg量取兩個或更多。單獨包裝，單獨用的供試品，無菌條件下取整個。接種至每個培養(yǎng)基中。檢查同