微生物多樣性之腸道微生態(tài)整體研究方案

1、高通量測序分析高通量測序分析對于微生物群落多樣性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq等第二代高通量測序平臺，對核糖體DNA高變區(qū)域，比如16S/18S/ITS等序列；或功能基因，比如細(xì)菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸鹽還原菌的異化型亞硫酸鹽還原酶基因進(jìn)行測序分析，揭示環(huán)境樣品中眾多不同類型微生物種類以及它們之間的相對豐度和進(jìn)化關(guān)系。高通量高通量測序優(yōu)勢測序優(yōu)勢1.測序通量高，可檢測到環(huán)境樣品中的痕量和微量微生物。2.PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行測序，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期短。3.微基生物開發(fā)了一套穩(wěn)定的多樣本平行測序?qū)嶒?yàn)方案，解決了樣本間數(shù)據(jù)量不平衡的技術(shù)難題，一次

2、可實(shí)現(xiàn)上百個樣品的平行測序。4.微基生物采用頂級期刊雜志Science中2012年7月發(fā)表文獻(xiàn)中的低偏差擴(kuò)增（LEA-SeqLEA-Seq）方法構(gòu)建文庫，更真實(shí)的還原樣本中微生物的分布比例。5. 微生物群落多樣性分析有Roche 454 FLX +和Illumina MiSeq兩種高通量測序平臺可供選擇，根據(jù)不同的測序要求提供不同的解決方案。6.專業(yè)的生物信息學(xué)分析人員，真實(shí)準(zhǔn)確的對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，針對客戶的不同需求，提供專業(yè)的分析流程和結(jié)果。生物信息學(xué)分析流程生物信息學(xué)分析流程【初級篇】微生物多樣性研究常用分析方法介紹雜亂序列OTU1OTU2OTU3OTU4熱圖【高級篇】微生物多樣性研

3、究高級分析方法介紹腸道微生態(tài)整體研究方案 Tingting Wang等采用454測序技術(shù)研究結(jié)直腸癌（CRC）患者與正常人群腸道微生物的菌落組成差異。并結(jié)合real-time PCR對相關(guān)基因進(jìn)行分析，最終確定丁酸鹽產(chǎn)生菌的減少和一些致病微生物的增加使得CRC患者腸道微生物菌落的失衡。 Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. 2012. The ISME Journal研究對象： CRC患者46人，健康人群56人研究區(qū)域：V3區(qū)測序平臺

4、：Roche 454 GS FLX案例：結(jié)直腸癌與腸道微生物結(jié)直腸癌與腸道微生物主要結(jié)果案例：結(jié)直腸癌與腸道微生物結(jié)直腸癌與腸道微生物（1）PCA主成分分析（圖a）和PCoA主坐標(biāo)分析（圖b）顯示CRC患者與正常人腸道微生物存在差異。藍(lán)色圓圈代表正常人，紅色圓圈代表CRC患者主要結(jié)果案例：結(jié)直腸癌與腸道微生物結(jié)直腸癌與腸道微生物（2）對CRC患者與正常人樣本在98%相似水平上OTU的相對豐度進(jìn)行RDA分析，找到健康人群與CRC疾病患者相關(guān)的微生物類群，進(jìn)行分析與CRC疾病相關(guān)的主要微生物類群。有48個OTU可以作一個關(guān)鍵變量與CRC患者和正常人腸道微生物結(jié)構(gòu)差異存在顯著相關(guān)性。主要結(jié)果案例：結(jié)

5、直腸癌與腸道微生物結(jié)直腸癌與腸道微生物（3）Heatmap分析：48個OTU的相對豐度作為健康人和CRC患者腸道微生物差異的主要變量，他們在樣本中的分布情況見下圖。圖左側(cè)黑色OTU代表在正常人中相對豐富，紅色OTU代表在CRC患者中相對豐富，每個樣本的顏色強(qiáng)度代表在所有樣本中的相對比率。腸道微生態(tài)整體研究方案Larsen等研究二型糖尿病患者腸道微生物與非糖尿病人群的差異，采用454測序技術(shù)結(jié)合qPCR技術(shù)對36個樣本腸道微生物進(jìn)行分析，結(jié)果表明二型糖尿病患者厚壁菌門和唆菌綱微生物比例較對照組顯著降低，但是變形菌綱微生物豐富。Bacteroidetes與Firmicutes的比例、Bactero

6、ides-Prevotella group 與 C. coccoides-E. rectale group的比例與血糖濃度呈正相關(guān)，而與BMI（體重系數(shù)）無關(guān)。變形菌綱微生物同樣與血糖濃度呈正相關(guān)。Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults. 2010. PLoS One.研究對象： 二型糖尿病患者18人，正常人18人研究區(qū)域：V4-V6區(qū)測序平臺：Roche 454 GS FLX案例：二型糖尿病與腸道微生物二型糖尿病與腸道微生物主要結(jié)果案例：二型糖尿病與腸道微生物二型

7、糖尿病與腸道微生物（1）Rarefaction Curve：確定取樣深度是否合理。主要結(jié)果案例：二型糖尿病與腸道微生物二型糖尿病與腸道微生物(2)PCA主成分分析：分析二型糖尿病患者與正常人腸道微生物在門與綱水平的差異。腸道微生態(tài)整體研究方案為了研究飲食對腸道微生物群落多樣性的影響，F(xiàn)ilippo CD等人比較了15個健康歐洲孩子（EU）及14個健康非洲農(nóng)村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而BF的食物則能代表傳統(tǒng)的非洲鄉(xiāng)下的飲食構(gòu)成。研究人員通過PCR擴(kuò)增29個糞便樣品進(jìn)行高通量測序。RDP數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示94.2%的reads屬于放線菌門（Actinobac

8、teria），擬桿菌門（Bacteroidetes），壁厚菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria），然而它們在EU和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌占大部分，而壁厚菌所占比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例較高。Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. 2010.PNAS.研

9、究區(qū)域：V5-V6區(qū)測序平臺：Roche 454 GS FLX案例：飲食與腸道微生物飲食與腸道微生物主要結(jié)果案例：二型糖尿病與腸道微生物二型糖尿病與腸道微生物EU（健康歐洲孩子）和BF（健康非洲農(nóng)村孩子）樣本中微生物分布統(tǒng)計 A：BF樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計；B：EU樣本中主要微生物的分布統(tǒng)計； C：全部樣本相似性分析；D：各樣本中主要微生物相對豐度統(tǒng)計； E：各樣本中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的相對豐度統(tǒng)計腸道微生態(tài)整體研究方案Turnbaugh PJ等人對胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對）、異卵雙胞胎（23對）及其母親（46個）共154個個體的腸道微生物進(jìn)行了研究。結(jié)果表明肥胖與腸道門級微生

10、物的變化相關(guān)，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）所占比例較低而放線菌門（Actinobacteria）所占比例較高。A core gut microbiome in obese and lean twins. 2009. Nature.研究區(qū)域：V2和V6區(qū)測序平臺：Roche 454 GS FLX案例：肥胖與腸道肥胖與腸道微生物微生物主要結(jié)果案例：肥胖與腸道微生物肥胖與腸道微生物1）A：不同胖瘦程度個體中主要門級別微生物分布及樣本之間相似性水平分析； B：第一主成分與主要擬桿菌門（Bacteroidetes）的相關(guān)性分析； C：雙胞胎之間，雙胞胎與母

11、親，不相關(guān)個體之間微生物功能相似性分析。主要結(jié)果案例：肥胖與腸道微生物肥胖與腸道微生物（2）根據(jù)隨機(jī)序列取樣與物種多樣性分析圖顯示：肥胖人較瘦人體內(nèi)微生物多樣性顯著降低。腸道微生態(tài)整體研究方案案例：不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同個體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在嬰幼兒、成年人和老年人這三類人群中具有顯著的差異，這表明隨著年齡的增長，腸道菌群也歷經(jīng)了巨大的變化。Claesson MJ等人收集了161位65歲以上老人及9位成年人腸道菌群的樣品，進(jìn)行焦磷酸測序。研究發(fā)現(xiàn)68%的個體腸道中最優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），平均比例約為57%，壁厚菌門（Firmicutes

12、）所占比例約為40%。但是和一些疾病或健康相關(guān)的菌群在不同個體中所占比例差別極大，包括變形桿菌門（Proteobacteria）,放線菌門（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物組與年青人也有鮮明差異，前者擬桿菌屬所占比例更大，梭菌屬在兩者之間具有不同的豐度模式。分析26組time-0和time-3 month糞便樣品，發(fā)現(xiàn)85%的個體在這兩個時間的微生物組成極其相近，這表明老年人的腸道菌群呈現(xiàn)出時間穩(wěn)定性。Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly. 2011. PNAS.研究區(qū)域：V4區(qū)測序平臺：Roche 454 GS FLX主要結(jié)果案例：肥胖與腸道微生物肥胖與腸道微生物A：本研究老年人與青年人糞便中核心微生物在