注射用A型肉毒毒素

1、注射用A型肉毒毒素Zhusheyong A Xing Roudu DusuBotulinum Toxin Type A for Injection本品系用A型肉毒結(jié)晶毒素經(jīng)稀釋，加入穩(wěn)定劑后凍干制成。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2制造2.1 菌種生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。2.1.1 名稱與來源生產(chǎn)用菌種為產(chǎn)毒力高的A型肉毒梭菌Hall株或其他A型肉毒梭菌。2.1.2 種子批的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。2.1.3 種子批的傳代主種子批應(yīng)不超過5代，工作種子批應(yīng)不超過10代

2、。2.1.4 種子批菌種的檢定檢定菌種可采用明膠瓊脂半固體培養(yǎng)基、血瓊脂平板培養(yǎng)基、乳糖卵黃瓊脂平板培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。菌種應(yīng)具有典型的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性，應(yīng)產(chǎn)生不低于1.0×105LD50/ml的A型肉毒毒素。2.1.5種子批保存主種子批和工作種子批均應(yīng)凍干保存于28以下；工作種子批也可用明膠瓊脂半固體培養(yǎng)基于-20保存接種于適宜培養(yǎng)基于8以下保存。2.2 原液2.2.1生產(chǎn)用種子啟開工作種子批菌種復(fù)蘇后，在適宜培養(yǎng)基上擴(kuò)增培養(yǎng)，制備生產(chǎn)用種子。2.2.2 產(chǎn)毒培養(yǎng)基采用含胰酶消化酪蛋白、酵母透析液（或酵母浸出粉）、葡萄糖培養(yǎng)基，或經(jīng)批準(zhǔn)的其他適宜培養(yǎng)基。2.2.3 菌種接種

3、和培養(yǎng)生產(chǎn)用種子接種產(chǎn)毒培養(yǎng)基后，在適宜溫度培養(yǎng)一定時(shí)間。每瓶取樣鏡檢，應(yīng)無雜菌，經(jīng)除菌過濾，即為原制毒素，其毒力應(yīng)為105106LD50/ml不低于1.0×105LD50/ml。2.2.4 毒素純化及結(jié)晶.1 原制毒素可經(jīng)等電點(diǎn)沉淀、核糖核酸酶處理、離子交換色譜、硫酸銨濃縮和透析及自然結(jié)晶等程序，或用經(jīng)批準(zhǔn)的其他適宜方法進(jìn)行純化。純化毒素經(jīng)自然結(jié)晶后即為結(jié)晶毒素，檢定合格后，置28避光保存。2.2.5 結(jié)晶毒素的透析用PB溶解結(jié)晶毒素，經(jīng)透析去除硫酸銨，除菌過濾后即為原液。2.2.6原液檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品配制2.3.1.1用PB溶解及透析毒素，除菌過濾后測定毒力。.2

4、用生理氯化鈉溶液將已知毒力的毒素溶液稀釋至適當(dāng)濃度。.32.3.1半成品配制將適量的稀釋毒素加入適宜穩(wěn)定劑中，使每1ml中毒素毒力在規(guī)定范圍內(nèi)。2.3.2半成品檢定按3.3項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。在凍干過程中制品溫度應(yīng)不高于35，真空或充氮封口。2.4.3規(guī)格每瓶含A型肉毒毒素50100U 50U、100U。2.4.4包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1結(jié)晶毒素檢定3.1.1結(jié)晶毒素在普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察，應(yīng)呈均一的針狀或棒狀結(jié)晶。3.1.2毒力測定可選擇下列一種方法進(jìn)行。結(jié)晶毒

5、素毒力應(yīng)為1.0×1051.0×106LD50/ml不低于1.0106LD50/ml。3.1.2.1本品溶解透析后做適當(dāng)倍數(shù)稀釋，按Broff法測定毒力，計(jì)算出本品的毒力。即取體重1416g小鼠5只，每只尾靜脈注射0.1ml本品（或稀釋的供試品），求其平均死亡時(shí)間（以分鐘計(jì)），從毒素劑量與死亡時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得毒素的毒力。3.1.2.2按常規(guī)方法稀釋本品，各稀釋度腹腔注射體重1416g小鼠4只，每只注射0.5ml，根據(jù)動(dòng)物4天內(nèi)死亡情況，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（Reed Muench法）計(jì)算本品的毒力。3.1.3純度測定3.1.3.1根據(jù)波長280nm處吸光度計(jì)算的蛋白質(zhì)濃度及3.

6、1.2項(xiàng)測定的毒力，求出結(jié)晶毒素的純度，每1mg蛋白質(zhì)純度應(yīng)在1.0×107LD50以上。3.1.3.2結(jié)晶毒素在波長260nm處吸光度與波長280nm處吸光度之比（A260/A280）應(yīng)不高于0.6。3.1.4特異性檢查取注射用水1ml，溶解A、B、C、D、E、F型凍干肉毒診斷血清，分別于各血清管中加1ml含100LD50左右的本品。另取2支試管，各加1ml生理氯化鈉溶液，再分別加入上述同濃度的本品溶液，其中1支煮沸20分鐘作為毒素陰性對(duì)照，另1支與混有毒素的診斷血清管同時(shí)置37結(jié)合45分鐘，作為毒素陽性對(duì)照。各組分別腹腔注射體重1416g小鼠23只，每只注射0.5ml，觀察4天，

7、記錄動(dòng)物存亡情況。本品應(yīng)為A型。3.2 原液檢定按3.3 半成品檢定無菌檢查依法檢查（附錄 A），應(yīng)符合規(guī)定。效價(jià)測定按項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)為標(biāo)示量的80%120%。3.4成品檢定除水分測定外，每瓶加入0.5ml滅菌生理氯化鈉注射液，復(fù)溶后進(jìn)行以下檢定。3.4.1鑒別試驗(yàn)按3.1.4項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。每批成品至少抽取1瓶做鑒別試驗(yàn)。3.4.2外觀應(yīng)為白色疏松體，復(fù)溶后輕輕搖動(dòng)，應(yīng)呈無色或淡黃色澄明液體。3.4.3水分應(yīng)不高于3.0%（附錄 D）。3.4.4效價(jià)測定取本品1020瓶混合測定效價(jià)。每瓶加入1ml生理氯化鈉溶液溶解復(fù)溶后，將等量混合的溶解毒素進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，各稀釋度分別腹腔注射體重1416g小鼠4只，每只注射0.5ml，觀察4天，記錄小鼠死亡數(shù)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算每瓶本品的LD50（1LD50定為1U）。應(yīng)為標(biāo)示量的80120。3.4.5無菌檢查依法檢查（附錄 A），應(yīng)符合規(guī)定。3.4.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查依法檢查（附錄 E）