內(nèi)皮素抗體在大鼠腎缺血再灌注損傷中的作用

1、內(nèi)皮素抗體在大鼠腎缺血/再灌注損傷中的作用*摘要目的和方法：為探討內(nèi)皮素在腎缺血/再灌注損傷中的發(fā)病學(xué)意義，本實(shí)驗(yàn)在大鼠腎缺血/再灌注損傷模型上，觀察了內(nèi)皮素抗體對(duì)腎缺血/再灌注損傷的作用。結(jié)果：腎缺血/再灌注損傷大鼠，血清尿素氮(SUN)、肌酐(SCr)含量及血漿內(nèi)皮素(PET)水平顯著升高；脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)產(chǎn)生增多；腎小管上皮細(xì)胞明顯損傷。應(yīng)用內(nèi)皮素單克隆抗體能顯著降低PET水平和MDA含量，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，改善腎功能。結(jié)論：內(nèi)皮素是參與腎缺血/再灌注損傷發(fā)病的重要因素之一，阻斷ET的生物學(xué)作用是防治腎缺血/再灌注損傷的有效途徑。主題詞腎；局部缺血；再灌注；內(nèi)皮縮血管肽

2、類；抗體 The role of ET-Ab in renal ischemia-reperfusion injury in ratsXIA Xiao-Hong, HE Rui-Rong*，SHEN Yu-Xue, SHI Ji-Cai, YU Zhan-JiuHebei Academy of Medical Sciences, Shijiazhuang (050021)*Hebei Medical University, Shijiazhuang Abstract AIM and METHODIn order to evaluate the possible role of ET-Ab in

3、 the pathogenesis of renal ischemia-reperfusion injury, the effect of ET-Ab on renal ischemia-reperfusion injury was investigated on a model produced by bilateral clamping the renal artery and vein followed by reperfusion in rats.RESULTS：Contents of SUN, SCr, MDA and level of plasma endothelin (PET)

4、 were significantly increased in renal ischemia-reperfusion injured rats, and the impairment of renal tubular epithelial cells was observed. ET-Ab might siginificantly decreased contents of SUN, SCr, MDA and level of PET, and attenuate the renal ischemia-reperfusion injury of rats.CONCLUSION：ET play

5、s an important role in the pathogenesis of ischemia-reperfusion injury. Blocking the biological actions of ET might be an effective means of preventing and treating ischemia-reperfusion injury.MeSHKidney; Ischemia, Reperfusion; Endothelins; Antibodies內(nèi)皮素(endothelin,ET)是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌和釋放的一種血管活性多肽，是迄今已知體內(nèi)作用

6、最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)1，研究表明，缺血性急性腎功能衰竭時(shí)，血漿內(nèi)皮素水平明顯升高，ET受體上調(diào)2，3。但也有研究認(rèn)為，缺血性急性腎功能衰竭時(shí)腎小球ET受體無(wú)變化4。目前，有關(guān)ET在腎缺血/再灌注損傷中的作用及其機(jī)制尚不十分清楚。本工作應(yīng)用內(nèi)皮素單克隆抗體(ET-Ab)，觀察其對(duì)大鼠腎缺血-再灌注損傷的作用，以進(jìn)一步驗(yàn)證ET在腎缺血/再灌注損傷中的發(fā)病學(xué)意義，并探索有效的防治措施。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：選用成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重220270 g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，置于1822實(shí)驗(yàn)室安靜飼養(yǎng)兩日后隨機(jī)分為3組，(1)缺血-再灌組(I-R，n=6)；(2)缺

7、血-再灌+ET抗體組(I-R+ET-Ab,n6)；(3)假手術(shù)組(Sham,n6)。二、藥品與試劑：ET-Ab(Penisula Lab)；戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)；尿素氮，肌酐試劑盒(石家莊試劑廠)；PET放免藥盒(解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所)；cGMP放免藥盒(上海中醫(yī)藥大學(xué))。三、實(shí)驗(yàn)程序：動(dòng)物經(jīng)2%戊巴比妥鈉(ip)麻醉后，I-R+ET-Ab組開腹暴露雙側(cè)腎動(dòng)靜脈，于夾閉腎動(dòng)靜脈前5 min，尾靜脈注射ET-Ab(5 L/100 g體重，110萬(wàn)單位)，夾閉雙側(cè)腎動(dòng)靜脈60 min后恢復(fù)灌流，逐層縫合腹膜、腹壁肌肉和皮膚，關(guān)閉腹腔；I-R組尾靜脈給予等量生理鹽水，余操作

8、同I-R+ET-Ab組；Sham組手術(shù)操作亦同I-R+ET-Ab組，尾靜脈給予等量生理鹽水，但不夾閉腎動(dòng)靜脈。再灌注后24 h取腹主動(dòng)脈血5 mL分別測(cè)定血漿內(nèi)皮素(PET，放免法)，血清尿素氮(SUN，二乙酰-肟法)，血清肌酐(SCr，苦味酸法)及血清丙二醛(MDA，硫代巴比妥酸法)，取血后迅速摘取左側(cè)腎臟，于冰板上切取同一部位腎組織，速凍于低溫冰箱內(nèi)待測(cè)cGMP，余固定于福爾馬林溶液中待做病理形態(tài)學(xué)觀察。四、統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用組間均值t檢驗(yàn)判定差異顯著性。結(jié)果一、ET-Ab對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠SUN和SCr的影響(表1)：表1ET-Ab對(duì)腎缺血/再灌注損傷大鼠

9、血清尿素氮和肌酐的影響Tab 1Effects of ET-Ab on contents of SUN and SCr in the renal I-R rats(,n=6)TreatmentSUN(mmol/L)SCr(mol/L)Sham7.061.4962.7610.61I-R25.853.25*130.8031.82*I-R+ET-Ab12.881.87*85.7415.03*P0.05，*P0.01，vs sham group；P0.05，P0.01，vs I-R group腎缺血-再灌注損傷大鼠SUN和SCr值明顯高于Sham組，而I-R+ET-Ab組大鼠SUN和SCr升高幅度明顯

10、低于I-R組（P0.05，P0.01)。二、ET-Ab對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠cGMP和MDA的影響(表2)：表2ET-Ab對(duì)腎缺血/再灌注損傷大鼠cGMP和MDA含量的影響Tab 2Effects of ET-Ab on contents of cGMP and MDA in the renal I-R rats (，n=6)TreatmentcGMP(pmol/mg WW)MDA(mol/L)Sham0.210.0323.863.16I-R0.100.03*43.381.66*I-R+ET-Ab0.220.0531.632.78*P0.01，vs sham group;P0.01，vs I

11、-R groupI-R組大鼠腎組織cGMP明顯低于Sham組，I-R+ET-Ab組與Sham組無(wú)顯著差異，但明顯高于I-R組。I-R組大鼠血漿MDA含量明顯高于Sham組，而I-R+ET-Ab組MDA升高幅度則明顯低于I-R組(P0.01)。三、ET-Ab對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠PET的影響(1)：Fig 1Effects of ET-Ab on level of PET in renal I-R in rats (，n=6)*P0.01， vs Sham; P0.01， vs I-R1ET-Ab對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠血漿ET水平的影響I-R組大鼠PET水平明顯高于Sham組(P0.01)，

12、I-R+ET-Ab組PET含量卻明顯低于I-R組和Sham組(P0.01)。四、ET-Ab對(duì)腎缺血-再灌注損傷大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷程度的影響(2)：Fig2Microphotographs showing the renal tubular epithelial cells from sham (A), I-R(B) and I-R+ET-Ab (C) preparations stained by HE(40)2光鏡示腎臟近曲小管上皮細(xì)胞Sham組腎組織形態(tài)學(xué)觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常，I-R組近曲小管呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性，伴有較多灶性壞死區(qū)。遠(yuǎn)曲管和集合管內(nèi)有大量蛋白管型。腎球囊內(nèi)尚可見到蛋白滲出

13、物。I-R+ET-Ab組病變明顯輕于I-R組，僅出現(xiàn)部分近曲管上皮細(xì)胞濁腫，少數(shù)細(xì)胞空泡變性，部分遠(yuǎn)曲管和集合管內(nèi)有少量蛋白管型，腎小囊內(nèi)未見蛋白滲出物。討論腎臟是對(duì)缺血/再灌注損傷非常敏感的器官5，以往研究表明，腎缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與氧自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷密切相關(guān)6，但確切發(fā)病機(jī)制至今未明。近年發(fā)現(xiàn)，腎血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和釋放的收縮(ET等)和舒張(NO等)因子失調(diào)對(duì)于腎缺血/再灌注損傷具有重要的發(fā)病學(xué)意義7，8。ET是迄今已知體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，組織缺血缺氧可使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，ET產(chǎn)生和釋放增多，ET又可進(jìn)一步使腎血管收縮，加重腎組織缺血缺氧。如能阻斷ET的生物學(xué)效應(yīng)，將

14、改善腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)、減輕腎缺血/再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)觀察到，夾閉大鼠雙側(cè)腎動(dòng)靜脈60 min再灌24 h后，腎功能明顯受損，SUN、SCr、 PET水平均明顯高于假手術(shù)組，應(yīng)用ET-Ab能明顯降低SUN、SCr及PET含量，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，改善腎功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ET參與腎缺血/再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程，而ET-Ab可通過(guò)中和體內(nèi)過(guò)多的ET，起到拮抗和阻斷ET的生物學(xué)效應(yīng)，改善腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)，減輕腎損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn)9，夾閉大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min再灌注5 min后，PET即開始升高，5 h時(shí)達(dá)最高值，20 h時(shí)PET恢復(fù)正常，認(rèn)為PET增加只在ARF初期起作用，而我們于再灌

15、注24 h時(shí)測(cè)得的PET水平仍維持在較高水平，這可能是由于模型制做方法不同所致。以往研究證實(shí)，氧自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷與腎缺血/再灌注損傷的發(fā)病有密切關(guān)系。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，腎缺血/再灌注損傷后，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA產(chǎn)生增多，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死。而應(yīng)用ET-Ab后，可明顯降低MDA含量，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷。研究表明，ET通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)鈣釋放和胞外鈣內(nèi)流，使胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用10。因此，我們認(rèn)為，ET-Ab阻斷ET的生物學(xué)作用，減輕胞內(nèi)鈣超載，一方面避免了由于胞內(nèi)高鈣引起的ATP降解，黃嘌呤氧化酶生成和磷脂酶激活，減少了自由基的來(lái)源；另一方面保護(hù)了線粒體功能及超氧化物歧

16、化酶(SOD)，使氧自由基能迅速清除。這可能也是ET-Ab改善腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)，減輕腎缺血/再灌注損傷的原因之一。cGMP對(duì)腎功能的有益作用已被證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，ET-Ab組cGMP水平較I-R組明顯增加，這可能對(duì)改善腎功能，減輕腎缺血/再灌注損傷也起到了積極的作用。*河北省自然科學(xué)基金資助(No.395420)作者單位:夏曉紅申玉學(xué)石紀(jì)才于占久河北省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所(石家莊 050021)何瑞榮河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所參考文獻(xiàn)1Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptid

17、e produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988,332:411.2Lopez-Farre A, Gomez-Garre D, Bernabeu F, et al. A role for endothelin in the maintenance of post-ischaemic renal failure in the rat. J Physiol (Lond), 1991,444:513. 3Nambi P, Pullen M, Jugus M, et al. Rat kidney endothelin receptors in

18、 ischemia-induced acute renal failure. J Pharmacol Exp Ther, 1993,264:345.4Wilks BM, Peal AR, Mento PF, et al. Glomerular endothelin receptors during initiation and maintenance of ischemic acute renal failure in rats. Am J Physiol, 1991,260:(1 pt2)F110.5戴龍君，李宏英，丁鼎武.自由基與缺血性腎臟損傷.國(guó)外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊(cè)，1986，3：3.6尹明，高治忠.氧自由基與腎缺血/再灌注損傷.國(guó)外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊(cè)，1988，5：217.7Chan