TDI對靶器官的自由基損傷作用

1、第25卷第6期 遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報 2006年12月 Vol.25 No.6 Journal of Liaoning Technical University Dec2006文章編號：1008-0562(2006)06-0940-03TDI對靶器官的自由基損傷作用于 蕾，季宇彬，紀紅蕊，郎 朗，蔣 暉( 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心 博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150076 )摘 要：為了揭示環(huán)境污染物甲苯二異氰酸酯（toluenediisocyanate，簡稱TDI）的毒性作用機制，采用靜式吸入染毒從自由基損傷的角度觀察了TDI對靶器官的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛

2、（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）的影響。結(jié)果表明，TDI可引起肺臟和睪丸的中MDA、NO含量增加，GSH和SOD在肺組織和睪丸組織中均有消耗，表明TDI可導(dǎo)致肺臟和睪丸內(nèi)氧自由基（）和一氧化氮自由基（NO·）的增多。提示：呼吸道接觸TDI可引起靶器官的自由基損傷，研究結(jié)果為該環(huán)境污染物的預(yù)防和早期診2·斷提供實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：甲苯二異氰酸酯；環(huán)境污染物；自由基損傷中圖分類號：R 994.5 文獻標識碼： AEffect of free radicals damage on targeted tissue of TDIYU Lei，JI Yu-bin，JI H

3、ong-rui，LANG Lang，JIANG Hui（Postdoctor Research Station of Research and Center on Life Sciences and Environmental Sciences,Harbin Commercial University, Harbin 150076, China）Abstract：To reveal the toxic mechanism of environmental infection: toluenediisocyanate(TDI), after inhaling TDI, MDA、GSH、SOD a

4、nd NO in targeted tissue are determined in view of free radicals damage. The content of MDA and NO increase significantly, while GSH and SOD are consumed in lungs and spermary. Results show thatTDI NO·to increase to some extent. Result: after many times of TDI exposure, the targeted could induc

5、e -2· andtissues are damnified by free radicals. The result will provide experimental basis for the prevention and early diagnoses of this environmental pollutant.Key words：toluenediisocyanate；environmental pollutant；free radicals damage0 引 言甲苯二異氰酸酯（toluenediisocyanate，簡稱TDI）為目前頗受關(guān)注的環(huán)境污染物之一。甲苯二

6、異氰酸酯（TDI）屬低毒類有機化合物，該物質(zhì)主要用于生產(chǎn)聚氨酯樹脂和聚氨酯泡沫，而廣泛用作墻面絕緣材料、密封地板、衛(wèi)生間等處。通過這些途徑釋放的TDI會經(jīng)呼吸道進入人體，產(chǎn)生長期的潛在的危害。近年來，隨著TDI應(yīng)用范圍的不斷拓展，TDI引起的職業(yè)性衛(wèi)生防護問題不斷上升1,21 實驗部分1.1 實驗材料、儀器及實驗動物TDI (化學(xué)純，95%)（購自天津市化學(xué)試劑分廠六廠）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷光肝肽（GSH）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合成酶（NOS）檢測試劑盒（購于南京建成生物制品公司）。尤尼柯紫外可見分光光度計；Bs型電子天平（德國）；F6/10型超細勻漿器（德國

7、弗魯克）。昆明種小鼠（SCXK(黑)20020001），購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心。 1.2 實驗方法選用25±5g的雄性昆明種小鼠，于50 L的靜式。本課題組前期工作已顯示，TDI具有一定的免疫毒性、生殖毒性、遺傳毒性，并已確定其靶器官主要為肺臟和睪丸3-5。因此，本次實驗將圍繞TDI對肺組織和睪丸組織的自由基損傷作用進行研究。收稿日期：2005-11-07第6期 于 蕾等：TDI對靶器官的自由基損傷作用 染毒罐中進行染毒，共設(shè)5個染毒劑量組，各組染毒劑量分別相當于1/2LC50、1/4LC50、1/8LC50、1/16LC50。連續(xù)染毒兩周，每天持續(xù)4h，染毒結(jié)束次日處死小鼠，取

8、肺和睪丸組織，用PBS（pH=7.4）制10%的組織勻漿。蛋白含量的測定采用考馬氏亮蘭法；SOD活性測定采用鄰苯三酚自氧化法；MDA活性測定采用TBA法；GSH活性測定采用二硫代二硝基苯甲酸法；NO水平測定采用硝酸還原酶法，NOS活力測定采用NOS催化L-Arg法。所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0進行t檢驗。941常顯著的差異(p<0.01)，并且隨著染毒劑量的增加，NO水平有上升的趨勢；iNOS活性經(jīng)歷了和NO水平變化相似的過程，且均呈非常顯著性差異(p<0.01)；NO含量與i-NOS活力經(jīng)SPSS軟件pearson相關(guān)性分析后，呈非常顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.9794，P<0

9、.01)，cNOS活性和NO水平的相關(guān)性呈非常顯著性(r=-0.337，P>0.05)。由表3可見，隨著染毒劑量的增加SOD的活性呈下降趨勢，1/2、1/4、1/8 LC50染毒組，SOD活性的降低與空白組比較呈非常顯著性差異（p<0.01）；除1/16LC50染毒劑量組外，MDA含量有不同程度的升高；而GSH的含量僅1/2LC50染毒劑量組與空白組相比較呈顯著性降低（p<0.05）。表3 TDI染毒對小鼠睪丸組織氧化損傷的影響Tab.3 effects of TDI on lipid peroxidation mices testist（n=8,±s）組別(SOD

10、) /(U·mg-1)m(MDA)/ (nmol·mg-1)0.180±0.014* 0.173±0.015* 0.135±0.012* 0.127±0.011 0.118±0.080w(GSH) /(mg·g-1)28.24±5.50* 35.65±4.59 35.06±4.20 37.11±3.40 34.66±3.702 實驗結(jié)果實驗結(jié)果（見表1）表明，1/16、1/8、1/4 LC50染毒劑量時，SOD活性的降低與空白組比較呈顯著性差異（p<0.05）

11、；隨染毒劑量的增加，MDA和GSH含量均有不同程度的增加。表1 TDI對小鼠肺臟的SOD、MDA和GSH的影響Tab.1 change of SOD、MDA and GSH in mice lung tissue ofTDI（n=8,±s）組別 1/2LC50 1/4LC50 1/8LC50 1/16LC50 controlSOD/(U·mg-1) 31.42±5.78 19.28±5.63* 19.16±4.04* 21.98±5.77* 30.00±11.54c(MDA)/(nmol·mL-1) 15.29&#

12、177;2.80* 14.22±2.16* 6.41±1.43* 4.99±0.39* 3.21±0.36w(GSH)/(mg·g-1) 53.23±12.40 34.91±6.56* 35.01±10.63* 29.88±3.94* 59.90±17.951/2LC5047.62±4.63* 1/4LC5051.61±3.78* 1/8LC5052.36±4.25* 1/16LC5063.61±5.85 Control62.42±7.24* 與

13、空白對照組比較P<0.05 * 與空白對照組比較P<0.01表4 TDI染毒對小鼠睪丸NO含量和NOS活性的影響 Tab.4 effect of different-dosage TDI on testis NO contentand NOS vitality of mice（n=8,x±s）組別m(NO)/ (µmol·g-1)i-NOS/(U·mg-1) c-NOS/(U·mg-1)1/2LC50 2.343±0.228* 2.156±0.195* 2.249±0.213 1/4LC50 1.504

14、±0.278* 2.115±0.464* 2.174±0.138 1/8LC50 1.008±0.139* 1.704±0.196* 2.271±0.183 1/16LC50 0.735±0.116 1.428±0.2742.196±0.145* 與空白對照組比較P<0.05 * 與空白對照組比較P<0.01表2 各組肺勻漿NO含量和NOS活力Tab. 2 NO content and NOS vitality in lung homogenatefrom groups（n=8,x±

15、s）組別m(NO)/ (µmol·g-1) i-NOS/(U·mg-1) c-NOS/(U·mg-1)1/2LC50 4.6714±0.5575* 1.0816±0.0157* 0.7149±0.2268 1/4LC50 3.2505±0.3266* 0.8812±0.1047* 0.7819±0.3949 0.6642±0.1510* 0.8745±0.3046 1/8LC50 2.7625±0.0636*1/16LC50 1.3131±0.5905*

16、0.4974±0.0989* 1.2731±0.2887*control 0.2621±0.2520 0.0998±0.0372 0.5016±0.1026 * 與空白對照組比較P<0.05 * 與空白對照組比較P<0.01control 0.685±0.100 1.165±0.257 2.246±0.370 * 與空白對照組比較P<0.05 * 與空白對照組比較P<0.01由表4可以看出，小鼠呼吸道接觸TDI兩周后， 1/2、1/4、1/8LC50染毒劑量組NO含量增加顯著 (p<0

17、.01)，并且隨著染毒劑量的增加，NO水平有上升的趨勢； iNOS活性經(jīng)歷了和NO水平變化相似的過程，其中1/2、1/4、1/8LC50染毒劑量組iNOS活性由表2可以看出，小鼠呼吸道接觸TDI 二周后，肺內(nèi)NO含量增加，與空白對照組比較，均具有非942增加非常顯著(p<0.01)。遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報 第25卷此外，過量的NO會使精子活力、活率下降，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加強，抑制生殖細胞的呼吸，從而造成生殖系統(tǒng)的損害作用10。本實驗結(jié)果顯示。小鼠呼吸道接觸TDI 14d后，各染毒劑量組小鼠睪丸組織中的NO含量均有所增加，并且隨著染毒劑量的增加，NO水平有上升的趨勢；iNOS活性經(jīng)歷了和NO水

18、平變化相似的過程。提示小鼠吸入TDI后，TDI作為一種小分子外來抗原可以增加iNOS的活性，產(chǎn)生大量的NO引起細胞毒作用，使小鼠睪丸微循環(huán)改變，睪丸組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加強，抑制生殖細胞的呼吸，從而造成TDI對小鼠睪丸的損害作用。3 討 論近年來，許多學(xué)者認為脂質(zhì)過氧化是諸多毒物作用的起點，也是細胞損傷的反應(yīng)形式之一6 。GSH的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要標志。MDA是細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物中具有代表性的產(chǎn)物，SOD是自由基的有效清除劑，SOD酶活性的降低，說明體內(nèi)需清除的自由基較多7。研究結(jié)果表明，小鼠吸入TDI后，引起肺組織、睪丸組織內(nèi)自由基的反應(yīng)，破壞了細胞的氧化代謝過程，造

19、成組織的損傷，主要表現(xiàn)在MDA含量增加，并隨吸入量的增加在肺組織、睪丸組織中進一步累積；而發(fā)揮自由基清除作用的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)的代表性指標GSH和SOD在肺組織和睪丸組織中均有消耗。呼吸道接觸TDI可以引起小鼠靶器官的MDA含量升高，說明導(dǎo)致2·大量增多，同時生成的NO·和2·有可能相互作用，共同導(dǎo)致氣道損傷，加重炎癥反應(yīng)。且iNOS本身也具有誘導(dǎo)2·生成活性8 ，可使ONOO-亦升高，增加NO·和2·對靶器官的損傷作用。TDI可以導(dǎo)致小鼠靶器官的SOD水平降低，說明其活性下降，一方面對2·的清除減弱，導(dǎo)致氧自由基對組織細胞損

20、傷加重；另的清除下降，使得2·與NO·反一方面，由于2·應(yīng)生成ONOO-的量大大增加，從而導(dǎo)致更嚴重的組織損傷，加重靶器官炎性損傷。小鼠吸入TDI后，通過產(chǎn)生各種自由基引起靶器官組織氧化損傷，氧化物質(zhì)與抗氧化物質(zhì)失衡所導(dǎo)致的氧化性器官組織損傷，可能是TDI毒性作用的一種主要機制。一氧化氮合成酶(NOS)是催化生成NO最重要的關(guān)鍵酶，NOS分為兩種，即誘導(dǎo)型NOS（iNOS）和原生型NOS（cNOS）。呼吸系統(tǒng)中，在 cNOS作用下產(chǎn)生生理劑量的NO具有舒張血管和支氣管平滑肌的作用，iNOS可以被內(nèi)毒素及某些細胞因子激活，產(chǎn)生大量NO而引起細胞毒作用9。本研究結(jié)果顯

21、示，吸入TDI可以使小鼠肺內(nèi)NO水平升高，并且隨著染毒劑量的增加，NO水平有上升的趨勢，并且TDI所引起的NO水平的升高是由于iNOS被激活、誘導(dǎo)所致。這種增高可能是由于氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肥大細胞和淋巴細胞等在過敏原及炎癥刺激下激活所致。此外，炎癥細胞產(chǎn)生的IL-1、TNF-、TNF-等細胞因子亦誘導(dǎo)iNOS表達其活性，致使NO大量釋放，而cNOS活性水平變化不大。4 結(jié) 論（1）TDI是一種多靶器官毒性的空氣污染物，對肺臟和睪丸都有一定的損傷；（2）TDI可造成小鼠肺臟和睪丸的氧化損傷； （3）TDI可引起小鼠肺臟和睪丸中NO含量升高，對組織產(chǎn)生損傷，NO水平的升高是由于iNOS被激活、誘導(dǎo)所致。 參考文獻：1 張雅萍.甲苯二異氰酸酯的生產(chǎn)和應(yīng)用J.氯堿工業(yè),1999,(3):15-18. 2 陶 梅,李愛國. PVC材料與產(chǎn)品對環(huán)境影響及其廢物管理J.遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報,2005 ,24(S) :259-261.3 季宇彬,于 蕾,紀紅蕊. 甲苯二異氰酸酯對免疫系統(tǒng)的毒性及作用機制J.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2005,37(3):362-367. 4 季宇彬,蔣 暉, 郎 朗. TDI對小鼠睪丸組織能量代謝的影響J. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 20