三七總苷對應激大鼠胃黏膜損傷及胃壁細胞超微結構的影響(一)

1、三七總苷對應激大鼠胃黏膜損傷及胃壁細胞超微結構的影響(一)    作者：鄧響潮，李燕舞，王汝俊【摘要】 目的觀察三七總苷對應激大鼠胃黏膜損傷及胃壁細胞超微結構的影響。方法采用經典的水浸-束縛應激模型,應激6 h后,大鼠處死剖腹取胃，肉眼計數(shù)各組胃黏膜糜爛、出血情況并計算潰瘍指數(shù)（UI）；在透射電鏡下觀察各組胃黏膜壁細胞超微結構改變。結果肉眼觀察正常對照組大鼠胃黏膜色澤紅潤，未見損傷性改變；模型組大鼠胃黏膜充血明顯，腺胃部可見散在斑點狀糜爛、出血，潰瘍指數(shù)為（16.83±4.96）；與模型組相比，三七總苷組和雷尼替丁組胃黏膜充血減少，UI值均明顯

2、下降(P0.01)。電鏡下，正常對照組大鼠胃壁細胞分泌小管少見，呈現(xiàn)明顯的靜息狀態(tài)，模型組分泌小管增多呈現(xiàn)泌酸激活狀態(tài)；與模型組比較，三七總苷組分泌小管擴張不明顯或明顯塌陷，細胞內囊泡樣結構增多；雷尼替丁組則見大量囊泡樣結構，分泌小管明顯減少。結論三七總苷可明顯減輕應激對胃黏膜的損傷，還可促進胃黏膜壁細胞從激活狀態(tài)向靜息狀態(tài)轉化，說明三七總苷對應激大鼠胃黏膜具有保護作用，可能通過調控壁細胞的泌酸功能而發(fā)揮其抗應激性胃黏膜損傷作用。 【關鍵詞】 應激性潰瘍 胃黏膜損傷 潰瘍指數(shù) 壁細胞 超微結構Abstract：ObjectiveTo observe the effect of total sa

3、ponins of Panax notognseng (PNS) on gastric mucosal lesion and ultrastructure of gastric mucosal parietal cells of stress rats. MethodsWater-immersion restraint stress (WRS)was used to induce rat models of stress. Six hours after WRS, the rats were executed to obtain the gastric tissue. The erosion

4、and hemorrhage of gastric mucosa in rats were observed by naked eyes, and then the ulceration index (UI) was calculated. The ultrastructure of gastric mucosal parietal cells in rats was observed under transmission electron microscope. ResultsThe results observed by naked eyes showed that no lesion w

5、as found in the normal group. However, in the model group, the gastric mucosal congestion was obvious, there existed scattered punctiform erosion and bleeding in the glandular stomach, and the UI was 16.83±4.96; compared with the model group, gastric mucosal congestion was reduced and UI decrea

6、sed in the PNS group and ranitidine group (P0.01). Under the electron microscope, there were less endocrine tubular villi in the parietal cells of the normal group, showing a static status. However, in the model group, the number of endocrine tubular villi increased, showing an activating status; co

7、mpared with the model group, the expansion of endocrine tubular villi was not obvious but the number of cytoplasm interior vesicles in parietal cells increased in PNS group, and in ranitidine group, the number of endocrine tubular villi was decreased and the number of vesicular structure was increas

8、ed.ConclusionPNS can reduce the stress-induced gastric mucosal lesion, and promote the wall cells of gastric mucosa transforming from the activated status into static status. The protective mechanism of PNS is probably related with the regulation of acid secretion of Parietal cell.Key words：Stress u

9、lcer; Gastric mucosal lesion; Ulceration index; Parietal cell; Ultrastructure應激狀態(tài)下，由于損傷因子的攻擊和防御作用的減弱，可出現(xiàn)下丘腦調控垂體等內分泌腺體功能障礙、胃黏膜微循環(huán)障礙、胃黏膜屏障受損、迷走神經興奮性異常增高、壁細胞激活、胃黏膜內脂質過氧化物含量升高和氧自由基產生增加等多方面改變1。目前國內外對應激狀態(tài)下壁細胞結構與功能變化的研究資料很少，三七總苷對應激大鼠壁細胞超微結構改變以及胃黏膜的保護作用也未見報道。本研究采用水浸-束縛應激的方法制作動物應激模型，觀察應激大鼠胃黏膜損傷程度及胃壁細胞超微結構的變化

10、，探討三七總苷對應激大鼠胃壁細胞超微結構的影響和對胃黏膜損傷的保護作用，為臨床應用三七總苷防治應激性潰瘍（SU）提供實驗依據。1 器材1.1 試藥三七總苷，購自云南植物藥業(yè)有限公司，產品批號：200205086；規(guī)格：原料藥，為淡黃無定形粉末；(Rb1+Rg1+R1)>60%,符合中國藥典2000版規(guī)定標準。鹽酸雷尼替丁膠囊，批號：H44021231，雅來（佛山）制藥有限公司生產。1.2 試劑與儀器動物手術器械一套，大鼠應激籠，自制。青島海爾冰箱、低溫冰箱、電子天平，臺式低溫離心機（德國）；電熱恒溫水槽，上海醫(yī)用恒溫設備廠生產；721型可見光分光光度儀，上海第三分析儀器廠生產；高速內切式

11、組織勻漿機，上海金達生化儀器廠生產；微量加樣器、凍存管、玻璃器皿等。恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠生產；電熱恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械五廠生產；H-800透射電鏡，日本日立公司生產。2 方法2.1 動物分組與給藥SPF級SD大鼠，36只，體重180220 g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證書：SCXK（粵）2003-0002，粵監(jiān)證字2007A004。實驗前適應性飼養(yǎng)1周（溫度2426。濕度60%70%）。上述動物隨機分為正常對照組、SU模型組、三七總苷低、中、高3個劑量組及陽性藥物（雷尼替?。┙M。各組預防性灌胃給藥或給同體積蒸餾水。2.2 試藥劑量設計因臨床成人靜脈滴注絡泰粉

12、針劑（三七總苷制劑）用量為200 mg/d/次，按成人60 kg體重計算，成人用藥劑量為每日3.3 mg/kg。故大鼠給藥按成人用量的5，10，20倍計算為16.5，33.0，66.0 mg/kg，即每千克體重給藥16.5，33.0，66.0 mg;各組動物預定給藥體積1 ml/100 g體重。三七總苷溶液配制：稱取三七總苷粉末99 mg,加蒸餾水溶解（加20滴吐溫20助溶），定容至60 ml,使終濃度為16.5 mg/ml；稱取三七總苷粉末198 mg,加蒸餾水溶解（加20滴吐溫20助溶），定容至60 ml,使終濃度為33.0 mg/ml；稱取三七總苷粉末198 mg,加蒸餾水溶解（加20滴

13、吐溫20助溶），定容至30 ml,使終濃度為66.0 mg/ml。2.3 應激實驗方法采用經典的水浸-束縛應激模型1。三七總苷組預防性給藥3 d，第3天末次給藥后（包括陽性藥雷尼替?。?，大鼠禁食24 h、禁水1 h 后,將各組大鼠放入自制的應激籠中，頭部朝上，固定四肢，然后將應激籠垂直放入恒溫水槽中 (19 ±1)水浴,水面平胸骨劍突。持續(xù)時間6 h。水浸-束縛應激模型制作完成后，將所有大鼠分別拉頸處死，剖腹并游離胃。取下胃后，沿胃大彎剪開胃壁使黏膜面外翻，用冰冷生理鹽水漂洗后，將胃黏膜面向上展平于潔凈濾紙上，肉眼仔細計數(shù)腺胃區(qū)點線狀糜爛、出血情況，按計數(shù)胃黏膜損傷潰瘍指數(shù)。每組任選

14、3只大鼠，于腺胃前后壁中央處，剪取5mm大小的胃黏膜標本，用剃須刀片于電鏡固定液4%多聚甲醛中切成1mm大小的組織數(shù)塊，用于制作電鏡標本。再用玻璃片刮下其余部分胃黏膜，放入凍存管內速凍，80冰箱保存。2.4 胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI)測定按Guth標準2計算潰瘍指數(shù)(UI)。觀察胃黏膜損傷的程度和形態(tài)。即點狀病變?yōu)?分；病變長度1 mm為2分，12 mm為3分；24 mm為 4分；病變>4 mm為5分；病灶寬度>1 mm時分值×2。將所有分值相加即為此只大鼠胃黏膜UI，以下列公式計算出抑制百分率3。 抑制百分率（%）=對照組潰瘍長度總和-實驗組潰瘍長度總和對照組潰瘍長度總和&

15、#215;100%2.5 透射電鏡標本制備取大鼠胃后,在墊有冰粒的平皿上，沿胃大彎剖開,迅速去除胃內容物,在胃竇部剪取5 mm×5 mm胃組織,并在生理鹽水中沖洗干凈, 于電鏡固定液4%多聚甲醛中切成1 mm3大小的組織數(shù)塊，置2.5%的戊二醛磷酸緩沖液中4下固定34 h，1%鋨酸(OsO4)固定40 min，巴比妥緩沖液浸洗，梯度乙醇、丙酮脫水,無水乙醇與環(huán)氧樹脂浸透、包埋,半薄切片定位。定位后將標本修成塊狀，超薄切片機將標本切成4060m厚的薄片，銅網撈片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,電子顯微鏡觀察并拍照。2.6 統(tǒng)計學分析應用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以

16、7;s表示，兩組間比較采用t檢驗，P0.05為有顯著性差異。3 結果3.1 應激大鼠胃黏膜損傷程度（潰瘍指數(shù)）及胃黏膜大體觀察 結果見表1。正常對照組大鼠胃黏膜色澤紅潤，未見損傷性改變。模型組大鼠胃黏膜充血明顯，腺胃部可見散在斑點狀糜爛、出血，UI為（16.83±4.96）；與模型組相比，三七總苷治療組和雷尼替丁組胃黏膜充血減少， UI值均明顯下降(P0.01)，提示水浸-束縛冷應激可致急性胃黏膜損傷，而三七總苷可以明顯減輕應激對胃黏膜的損傷，說明其對應激狀態(tài)下大鼠胃黏膜具有保護作用。見表1。本研究采用水浸-束縛應激模型，應激組大鼠胃黏膜可見明顯充血、糜爛、和潰瘍形成，說明動物模型制

17、作成功。預防性給予三七總苷和雷尼替丁后僅見胃黏膜輕度充血水腫，偶有黏膜表層脫落，出血、潰瘍發(fā)生較輕。結果提示三七總苷及雷尼替丁均可明顯預防大鼠應激性潰瘍的發(fā)生。表1 應激大鼠胃黏膜損傷程度及抑制率比較（略）與模型組比較,P0.01;n=63.2 透射電鏡觀察應激大鼠壁細胞形態(tài)變化結果見圖1ad。正常對照組大鼠胃壁細胞呈圓形，細胞表面微絨毛排列整齊密集，細胞內可見大量線粒體及散在分布的囊泡和管泡狀結構，分泌小管少見，且分泌小管內絨毛稀少或者缺如，呈現(xiàn)明顯的靜息狀態(tài)，見圖1a。模型組的壁細胞內囊管泡結構明顯減少或消失，分泌小管增多，有的分泌小管可見開口于細胞膜表面，分泌小管內絨毛增多增長，排列密集

18、，胞漿內的線粒體豐富，細胞呈現(xiàn)泌酸激活狀態(tài)。見圖1b。說明水浸束縛應激可激活大鼠胃壁細胞泌酸狀態(tài)，引起胃酸分泌增加，胃酸的分泌狀態(tài)與壁細胞超微結構的改變相一致，并與胃黏膜損傷程度有明顯相關性。與模型組比較，三七總苷組大鼠的壁細胞內可見少量分泌小管擴張明顯，小管內絨毛分布或稀少或密集，有的細胞內分泌小管明顯塌陷，出現(xiàn)膜包繞的高致密影像，細胞內囊泡樣結構增多；而雷尼替丁組的壁細胞內可見大量的囊泡樣結構，分泌小管明顯減少。實驗結果表明，預防性應用三七總苷和雷尼替丁，可改善應激狀態(tài)下壁細胞激活的超微結構改變，二者均能有效地抑制壁細胞的酸分泌，較好地發(fā)揮了預防應激性潰瘍的作用見圖1cd。圖1 三七總苷對

19、應激大鼠胃黏膜壁細胞超微結構的影響（略）4 討論對應激性潰瘍的認識始于100年前。1842年Curling報告了1例大面積燒傷患者并發(fā)十二指腸潰瘍，1932年Cushing報告了中樞神經系統(tǒng)創(chuàng)傷或手術可并發(fā)胃十二指腸潰瘍。隨著胃腸生理學、重癥監(jiān)護醫(yī)學等相關學科的發(fā)展，使人們對SU的研究更加深入全面，對其發(fā)生機制有了進一步認識。自1969年Guilbert提出應激的概念以來，人們逐漸認識到許多應激因素在細胞和器官水平，干擾機體正常的新陳代謝而導致各種疾病。目前，實驗和臨床研究都致力于探討不同應激因素對機體的影響及作用機制。胃酸是最常見的內源性損傷因子，已取得了明確的研究結果和結論4，5。壁細胞的

20、功能主要是泌酸，其超微結構改變與泌酸程度有關。陸國明等6的研究證明了水浸-束縛應激可引起大鼠胃壁細胞結構的改變，并與胃黏膜損傷程度有明顯相關性。李兆申等7通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)水浸束縛應激大鼠，壁細胞呈現(xiàn)明顯的分泌狀態(tài)，從形態(tài)學上證實了水浸-束縛應激可刺激胃酸分泌。胃是人體對應激反應最敏感的器官。胃黏膜對缺血缺氧極其敏感，所以胃黏膜缺血缺氧是導致應激性潰瘍的最基本條件8。本課題以大鼠水浸束縛模型為研究對象，觀察應激后胃黏膜損傷情況以及胃壁細胞超微結構變化,并觀察三七總苷對應激狀態(tài)下胃黏膜損傷及對壁細胞超微結構的影響。實驗結果證實水浸-束縛應激時，胃黏膜出現(xiàn)廣泛的糜爛、出血、潰瘍形成。通過UI及抑

21、制率比較，發(fā)現(xiàn)三七總苷可以明顯減輕應激對胃黏膜的損傷，說明其對應激狀態(tài)下大鼠胃黏膜具有保護作用。實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠經水浸-束縛應激后致急性胃黏膜損傷的同時，壁細胞呈現(xiàn)不同程度的激活狀態(tài)，尤以模型組為明顯，壁細胞內分泌小管絨毛密集，胞漿內囊泡基本消失，呈明顯的泌酸激活狀態(tài)，并且這些超微結構的變化與胃黏膜損傷的大體觀察相一致。提示應激因素可以激活壁細胞泌酸功能，從而加重胃黏膜損傷，而三七總苷可促進胃黏膜壁細胞從激活狀態(tài)向靜息狀態(tài)轉化，說明三七總苷對應激大鼠胃黏膜具有保護作用，可能通過調控壁細胞的泌酸功能而發(fā)揮其抗應激性胃黏膜損傷作用。已有研究證實，三七總苷可通過抗自由基損傷和減輕脂質過氧化實現(xiàn)對腎缺血

22、再灌注損傷的保護作用9；三七皂苷能有效改善內皮功能，具有顯著降低血小板表面活性、抑制血小板黏附和聚集、降低血黏度、改善微循環(huán)、抗血栓形成等作用10。通過本實驗胃黏膜和壁細胞超微結構形態(tài)學方面的觀察，說明預先給予三七總苷防治應激性潰瘍的作用是明顯有效的，我們下一步的實驗研究，將從三七總苷對氧自由基的影響，進一步探討其抗氧化損傷的作用機制，為臨床使用三七總苷預防和治療SU提供理論依據?！緟⒖嘉墨I】1 Samini M, Moezi L ,Jabarizadeh N, et al .Evidences for involvement of nitric oxide in the gastroprotective effect of bromocriptine a