高活性苧麻脫膠菌制霉菌素抗性菌株的選育-生物技術(shù)通報

1、高活性苧麻脫膠菌制霉菌素抗性菌株的誘變選育（生物技術(shù)通報2009.12）曾瑩1，向新柱2（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 武漢 430068；2.武漢科技學(xué)院 武漢 430073）摘要：利用制霉菌素抗性來篩選高滲透性突變株，提高黑曲霉菌對苧麻纖維的脫膠能力，使微生物脫膠能用于工業(yè)生產(chǎn)實踐之中。分別用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝酸作為誘變劑對黑曲霉菌株進(jìn)行誘變處理。以制霉菌素抗性為遺傳標(biāo)記，從突變菌株中定向篩選得到一株高活性苧麻脫膠菌黑曲霉。在以未經(jīng)刮制的苧麻韌皮為主要碳源，0.7%(NH4)2SO4為氮源，添加0.05%KCl;0.05%MgSO4;0.1%K2HPO4; 0.1%酵母膏；Tween

2、80 0.1%的培養(yǎng)液中，接入黑曲霉，置30下，150r/min處理30hr左右，脫膠苧麻纖維的殘膠率平均為14.43%。關(guān)鍵詞：誘變育種，定向篩選，制霉菌素抗性，苧麻脫膠菌，黑曲霉.中圖分類號：TS192.55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：AMutation Breeding of Nystatin resistant microorganismwith high Ramie Degumming activity.Zeng Ying1, Xiang xin zhu2,(1.College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan ,43

3、0068）（2.Wuhan Institute of Science and Technology, Wuhan ,430073）Abstract:In order to improve the ramie degumming capability of Aspergillus niger strain, Nystatin resistance was employed for screening high permeable mutation strain so that microorganism degumming can be applied into industrial produ

4、ction. The Aspergillus niger strain was mutated by UV light, DES, and nitrite treatment. The strain Aspergillus nigerAspergillus niger unwipered ramine bast as the main carbon source, 0.7% (NH4)2SO4 as nitrogen source, in addition with 0.05%KCl; 0.05%MgSO4; 0.1%K2HPO4; 0.1% yeast extract；Tween80 0.1

5、%.This incubation lasted 30hr at 30 and 150r/min, the average residual gum content of ramie fiber was 14.43%.Key Words: mutation breeding；directive breeding；nystatin resistance；degumming strain of ramie；Aspergillus niger.苧麻脫膠是影響苧麻纖維紡織加工的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的化學(xué)法脫膠不僅對苧麻纖維有一定的損傷，會嚴(yán)重污染環(huán)境，而且破壞了苧麻纖維本身具有的多種對人體有益的保健功能，殘留的

6、化學(xué)物質(zhì)影響人體健康。1生物法脫膠則是利用微生物或微生物產(chǎn)生的酶將膠質(zhì)分解。其作用條件溫和，對纖維損傷小，還能提高苧麻纖維的光澤度，而且生物法脫膠耗水少，污染輕，有利于環(huán)境保護(hù)2-3 。多年來，國內(nèi)外在微生物脫膠方面進(jìn)行了一系列的研究，但因所篩選到的脫膠菌株脫膠關(guān)鍵酶活力不高或分泌的酶系不全，苧麻經(jīng)微生物脫膠處理后仍然不能達(dá)到紡織工業(yè)生產(chǎn)上對苧麻纖維的要求，而未能完全替代化學(xué)脫膠廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中4-6 。為了提高菌株脫膠的能力，一個重要方法是進(jìn)行誘變育種。而選用合適的誘變劑及特殊的篩選方法(即“篩子”)是提高誘變效果的關(guān)鍵所在。本研究試圖對篩選得到的一株苧麻脫膠菌分別用紫外作者線、硫酸二乙

7、酯、亞硝酸作為誘變劑進(jìn)行誘變處理，以Nystatinr為標(biāo)記，定向篩選得到高活性苧麻脫膠菌。 1.材料與方法1.1材料原麻 未經(jīng)刮制的有殼苧麻 由湖北省咸寧市天化麻業(yè)公司提供菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）主要試劑：木聚糖、果膠，美國sigma公司；羧甲基纖維素鈉，上海化學(xué)試劑公司。斜面培養(yǎng)基： 蔗糖20g，酵母膏10g，蛋白胨10g，瓊脂20g，PH自然 選擇平板培養(yǎng)基：上層為無機鹽溶液（K2HPO4 0.7 g，NH4NO3 1.0 g，NaCl 0.005 g，ZnSO4 0.002 g，KH2PO4 0.7 g，MgSO4 0.7 g，MnSO4 0.001 g，F(xiàn)e

8、SO4 0.002 g，H2O 1000ml），去氧膽酸鈉 1.0 g，苧麻韌皮粉 10.0 g，瓊脂 20.0 g，PH自然。下層為無機鹽溶液1000ml，瓊脂20.0 g，PH自然脫膠發(fā)酵培養(yǎng)基：苧麻條60 g，酵母膏4.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，（NH4）2SO4 7.0 g， Tween80 1.0 g，H2O 1000ml，pH自然。1.2方法菌種的活化 將保藏菌種接入斜面培養(yǎng)基中，置30 OC下培養(yǎng)3d最低抑菌濃度（MIC）的測定用稀釋平板法測定nystatin對黑曲霉的最低抑菌濃度（MIC）。誘變處理以DES、HNO2、UV為誘

9、變劑，分別用不同劑量的誘變劑對出發(fā)菌株的孢子懸浮液進(jìn)行處理。突變株的分離將經(jīng)誘變處理的孢子懸浮液涂于含最低抑菌濃度nystatin的選擇平板上，置30下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72hr左右，觀察并記錄結(jié)果,生長良好的菌落即為抗性突變株。將突變株接入斜面培養(yǎng)基上，置適宜條件下培養(yǎng)。突變株的篩選1.2.5.1平板初篩 往含最低抑菌濃度nystatin的選擇平板上注入Lugol I2液，染色5min；用生理鹽水漂洗5 min后，測HC值。HC值透明圈直徑/菌落直徑1.2.5.2搖瓶初篩（脫膠發(fā)酵實驗） 將孢子濃度為3.05.0×106個/ml的孢子懸浮液定量接入搖瓶篩選培養(yǎng)基中，置30下150r/

10、min,培養(yǎng)30hr左右，測定殘膠率。.3復(fù)篩：苧麻生物脫膠實驗 殘膠率的測定根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB5889-86測定脫膠麻纖維的殘膠率。酶活力的測定.1酶液的制備 取置一定條件下的培養(yǎng)瓶，將脫膠培養(yǎng)液過濾，濾液即為酶液。.2纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶活力測定 用DNS法7.酶活力單位定義為：在50、PH4.6條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1g還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，以U/ml表示。即：酶活單位NG/ 0.1×10g還原糖/min.其中 N酶液稀釋倍數(shù)；G酶解液中還原糖的含量，g；0.1 加酶液量，ml 10酶解時間(min)2.結(jié)果與分析2.1最低抑菌濃度（MIC）的測定制備nys

11、tatin系列濃度梯度稀釋液，分別加入選擇平板培養(yǎng)基中，取孢子懸液點接于平板上，30 oC培養(yǎng)40 hr左右，觀察平板上的菌株生長情況，確定nystatin對出發(fā)菌株的最低抑制濃度（以未長菌平板所含最低藥物濃度為藥物對出發(fā)菌株的最低抑制濃度）。由表1可知隨著nystatin濃度增加，平板上菌株的生長量下降，當(dāng)選擇平板培養(yǎng)基中nystatin的濃度達(dá)到8.75 ug/ml時平板上無菌落形成。故nystatin對黑曲霉菌株的最低抑菌濃度為8.75 ug/ml。表1 nystatin對黑曲霉生長的影響Tab 1. Effect of nystatin on the growth of Aspergi

12、llus nigerNystatin(ug/ml)11.25108.757.56.255.03.750growth- - - - - - -+ + + + + + + + + +注：表中+；表示菌株生長，+的個數(shù)表示菌株生長量。-；表示未長菌。2.2突變株的分離篩選 從含nystatin最低抑菌濃度的平板上分離到63株nystatin抗性突變株，通過平板培養(yǎng)測定HC值和搖瓶發(fā)酵檢測殘膠率，其中16 株的脫膠效果較好。表2. 突變株初篩結(jié)果Tab 2. Initial screening result突變株HC值殘膠率（%）突變株HC值殘膠率（%）突變株HC值殘膠率（%）3.0.2-32.791

13、7.413.0.2-261.6314.383.0.2-512.6815.883.0.2-42.2217.063.0.2-382.5714.723.0.2-562.9814.843.0.2-81.6815.413.0.2-392.1414.213.0.2-573.5615.223.0.2-132.4415.143.0.2-411.5615.053.0.2-602.1915.613.0.2-192.4114.733.0.2-422.2214.75出發(fā)株3.0.2-252.9413.703.0.2-482.9315.29An3.0.22.2816.97注：以上數(shù)據(jù)為三次實驗的平均值。由表中數(shù)據(jù)可見H

14、C值與殘膠率并不一定成正相關(guān)。這可能與菌株在平板上和在搖瓶中的培養(yǎng)環(huán)境有所不同有關(guān)8-10。其中與出發(fā)菌株比較，殘膠率降低了13%以上的菌株有6株，其膠質(zhì)去除率見表3。其中-25的脫膠效果最好，膠質(zhì)去除率達(dá)65.21%比出發(fā)株提高了14.58%。表3.主要突變株的脫膠能力Table 3. Degumming activity of major mutants突變株膠質(zhì)去除率（%）突變株膠質(zhì)去除率（%）3.0.2-1962.603.0.2-3862.623.0.2-2565.213.0.2-4262.543.0.2-2663.483.0.2-3963.92出發(fā)株56.91苧麻微生物脫膠的原理是利

15、用脫膠菌發(fā)酵產(chǎn)生的脫膠酶作用于苧麻，將苧麻中的膠質(zhì)酶解為可溶于水的小分子物質(zhì)，獲得分離的纖維束11-12。為此，對膠質(zhì)去除率在63.%以上的3個菌株進(jìn)行酶活力的測定，依據(jù)高木聚糖酶活、果膠酶活，低纖維素酶活、殘膠率的原則進(jìn)行篩選。結(jié)果見表4.表4. 突變株復(fù)篩結(jié)果Tab 4. Secondary screening result.突變株酶活力（ug/ml）殘膠率（%）木聚糖酶果膠酶纖維素酶3.0.2-252238.844723.63116.1112.733.0.2-263966.55599.99112.511.993.0.2-391895.93410.0078.8914.18由以上表中數(shù)據(jù)綜合

16、分析可見，-26菌株較好。將以上菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接6代進(jìn)行脫膠發(fā)酵，分別測定殘膠率,結(jié)果見表5。比較可見-26菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。表5.菌株的穩(wěn)定性Table 5.Stability of the strain傳代次數(shù)（代）123456標(biāo)準(zhǔn)差（S）殘 膠 率（%）3.0.2-25菌株12.6914.7313.6913.7414.1115.410.9370253.0.2-26菌株13.4814.4315.2414.0213.8015.60.8357613.0.2-39菌株13.7115.8913.0413.9516.4414.561.3190513.小結(jié)以Nystatinr為標(biāo)記，從經(jīng)過誘變育種處理

17、的突變株中定向篩選得到一株高活性苧麻脫膠菌黑曲霉-26。后，脫膠麻的殘膠率平均為14.43%，比出發(fā)株下降了14.97%。雖然經(jīng)菌株脫膠處理后脫膠麻的殘膠率偏高，達(dá)不到紡織工業(yè)生產(chǎn)上對苧麻纖維殘膠率的要求（殘膠率2.0%），但是可以通過再進(jìn)一步育種處理提高菌株的脫膠能力以及進(jìn)一步優(yōu)化脫膠工藝使脫膠麻纖維含膠率降低，為更好地應(yīng)用現(xiàn)代生物科技制備高品質(zhì)麻纖維材料，實現(xiàn)綠色加工創(chuàng)造良好條件。參考文獻(xiàn)：1.杜兆芳，曹建飛，張強. 苧麻復(fù)配生物酶脫膠工藝的研究J.蘇州大學(xué)學(xué)報（工科版），2008，28（2）：27-29Du Zhaofang,Cao Jianfei,Zhang Qiang. Proces

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