二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

1、二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌         08-03-20 14:08:00     作者：王艷 葉冬青    編輯：studa20【摘要】  目的 建立二重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(duplex realtime PCR)快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。方法 采用二重SYBR Green實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)MRSA的決定基因mecA和金葡菌的種特異性基因nuc，經(jīng)熔解曲線分析鑒定產(chǎn)物。結(jié)果 所有MR

2、SA菌株的熔解曲線均呈現(xiàn)mecA、nuc基因特異性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌僅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌僅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌與其他菌種的菌株無(wú)特異峰出現(xiàn)；當(dāng)MRSA菌濃度達(dá)102cfu/ml時(shí)就可檢出。在131株金葡菌中，30.53%(40/131)耐藥；二重實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增mecA基因29.01%(38/131)陽(yáng)性，nuc基因100%陽(yáng)性。單引物與二重實(shí)時(shí)PCR兩者陽(yáng)性擴(kuò)增符合率為100%。結(jié)論 對(duì)mecA、nuc基因進(jìn)行二重實(shí)時(shí)PCR能準(zhǔn)確、快速地鑒定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶陰性的葡萄球菌。 【關(guān)鍵詞】  實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) 耐甲氧西林金葡菌 mecA基因 n

3、uc基因    Rapid detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus     ABSTRACT  Objective  To establish a duplex realtime polymerase chain reaction (PCR) assay for rapid detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA).  Method 

4、; A duplex SYBR   Green realtime PCR assay targeting the mecA gene and a Staphylococcus aureus specific markernuc gene and identifying PCR products through melting curve analysis was used to rapidly identify MRSA.  Results  All MRSA strains tested in the study presented mecA and

5、nuc gene specific peaks in the melting curve analysis; methicillinsusceptible Staphylococcus aureus (MSSA) strains only had a nuc peak, methicillinresistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) strains only had a mecA peak, and methicillinsusceptible Staphylococcus epidermidis (MSSE) strains and strain

6、s of species other than staphylococci had no peak. MRSA strains could be detected, by use of this duplex realtime PCR in an 102 cfu/ml inoculum. Positive rate of drug sensitivity test was 30.53% (40/131) among 131 S.aureus isolates tested, of which 29.01% (38/131) were positive for mecA gene and all

7、 were positive for nuc gene in the duplex realtime PCR. The agreement between simplex and duplex realtime PCR was 100% for positive results.  Conclusion  This study shows that the duplex realtime PCR assay with the primers for to mecA and nuc genes is a valuable tool for rapid and precise

8、identification of MRSA and methicillinresistant coagulasenegative staphylococci (MRCNS).    KEY WORDS  Realtime polymerase chain reaction (RTPCR);  Methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA);  mecA gene;  nuc gene收稿日期：20060615    修回日期：20061030

9、    金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要的人類病原菌，在整合了葡萄球菌盒式染色體mec元件(staphylococcal cassette chromosome mec element，SCCmec)并經(jīng)歷幾次突變可演化成耐甲氧西林金葡菌(methicillinresistant Staphylococcusaureus，MRSA)，導(dǎo)致包括萬(wàn)古霉素在內(nèi)的幾乎所有抗生素治療的失敗1。因此，快速、準(zhǔn)確地鑒定MRSA是控制院內(nèi)感染的先決條件。    MRSA對(duì)甲氧西林耐藥的機(jī)制主要是由青霉素結(jié)合蛋白PBP2a介導(dǎo)的，SCCm

10、ec中的mecA基因是PBP2a的編碼基因2。金葡菌的胞外熱穩(wěn)定核酸酶的基因序列nuc具有種的特異性3。我們運(yùn)用二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(realtime polymerase chain reaction)檢測(cè)金葡菌臨床分離株的nuc基因和mecA基因，在進(jìn)行菌種確認(rèn)的同時(shí)快速鑒定MRSA。    1  材料與方法    1.1  材料    (1)菌株來(lái)源  2005年9月從安徽省35所醫(yī)院臨床標(biāo)本中無(wú)重復(fù)分離的131株金葡菌和6株凝固酶陰性的表葡菌；標(biāo)準(zhǔn)菌株金葡菌ATC

11、C33591(MRSA)和金葡菌ATCC29213(MSSA)以及大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853等均由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科提供。    (2)主要試劑  SYBR  Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司，是一種二倍濃度的預(yù)混試劑(包含熱啟動(dòng)DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS、反應(yīng)用緩沖液、dNTP、SYBR  Green I等)并附帶參比染料ROX Reference Dye II(50×)；

12、MuellerHinton瓊脂(英國(guó)Oxoid公司)；頭孢西丁鈉(海南海藥公司?？谥扑帍S)。    (3)主要儀器  ABI Prism  7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，多點(diǎn)接種儀(英國(guó)AQS Manufacturing公司)。    (4)實(shí)時(shí)PCR引物  nuc基因的引物NUC1/NUC2，mecA基因的引物MECA1/MECA2分別擴(kuò)增MRSA的279和222bp片段35。兩種引物對(duì)均委托TaKaRa公司合成(表1)。   

13、 1.2  方法    (1)細(xì)菌培養(yǎng)與模板制備  將實(shí)驗(yàn)用菌種復(fù)蘇后，分別劃線接種到MH瓊脂平板上，35培養(yǎng)24h后，挑取單個(gè)菌落溶于100l滅菌蒸餾水中。菌懸液95水浴15min，7000r/min離心1min，棄沉淀、留上清液作為PCR反應(yīng)的DNA模板。    表1    nuc、mecA二重實(shí)時(shí)PCR的引物序列    引物GenBank號(hào)序列(53)Tm()NUC1V01281GCGATTGATGGTGATACGGTT55.9  (511

14、531)NUC2V01281AGCCAAGCCTTGACGAACTAA60.4  AGC(766789)MECA1X52593GCAATCGCTAAAGAACTAAG51.3  (693712)MECA2X52593GGGACCAACATAACCTAATA51.3  (895914)    (2)nuc或mecA基因單一引物實(shí)時(shí)PCR  25l的反應(yīng)體系中包含有12.5l的SYBR  Premix Ex TaqTM(2×)、0.5l的ROX Reference Dye II(50×)、2l的DN

15、A模板、上游和下游引物各0.2mol/L。在ABI Prism  7500 PCR儀上經(jīng)95、10s的模板預(yù)變性后，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增即95變性5s、60退火和延伸34s。最后一個(gè)循環(huán)的熔解程序?yàn)椋?5，15s；58，1min；95，15s。溫度變化率除了從58升至95這一步為0.1/s，其余均為20/s。熒光信道設(shè)置在F1(530nm)處，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在每個(gè)循環(huán)的60、34s退火和延伸步驟。    (3)nuc、mecA基因二聯(lián)引物實(shí)時(shí)PCR  反應(yīng)總體積為25l，包括：2×SYBR  Premix Ex Taq

16、TM 12.5l，50×ROX Reference Dye II 0.5l，DNA模板2l，引物NUC1、NUC2各0.2mol/L，引物MECA1、MECA2各1.0mol/L。擴(kuò)增程序與單一引物實(shí)時(shí)PCR相同。每次試驗(yàn)均包括陽(yáng)性對(duì)照(MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株)和陰性對(duì)照(模板DNA由無(wú)菌水取代)。    (4)數(shù)據(jù)分析  反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)SYBR  Green I實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線，結(jié)合CT(threshold cycle，閾循環(huán))值、Tm(melting temperature，熔解溫度)值判定結(jié)果。樣本菌的擴(kuò)增CT值35且熒

17、光曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；Tm值在MRSA標(biāo)準(zhǔn)株的Tm(mecA)±0.3范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為mecA基因陽(yáng)性，Tm值在標(biāo)準(zhǔn)株的Tm(nuc)±0.5范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為nuc基因陽(yáng)性。隨機(jī)選取部分野生株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。    (5)特異性試驗(yàn)  用于檢測(cè)該二重實(shí)時(shí)PCR體系特異性的相關(guān)菌株如前所述。    (6)靈敏度試驗(yàn)  MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌純培養(yǎng)增菌后，將上述增菌液各稀釋成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等八個(gè)梯度。取一份稀釋液用煮沸

18、法提取核酸作為模板上熒光PCR儀；另取一份用來(lái)涂布三個(gè)平板，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。    (7)抗生素敏感性試驗(yàn)  以ATCC29213為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，按照2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂平皿對(duì)倍稀釋法測(cè)定頭孢西丁對(duì)金葡菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)6：頭孢西丁的MIC8g/ml為敏感，等于16g/ml為中介，32g/ml為耐藥。    2  結(jié)果    2.1  nuc基因、mecA基因的檢測(cè)    熔解曲線分析表明，所有金葡菌在nuc基因單一引物實(shí)時(shí)PCR中