鼠疫病原學及鼠疫實驗室管理及運行

1、鼠疫病原學及鼠疫實驗室鼠疫病原學及鼠疫實驗室管理和運行管理和運行鼠疫病原學鼠疫病原學 一、鼠疫菌的生物學特性一、鼠疫菌的生物學特性 （一）（一）形態(tài)和染色：形態(tài)和染色：典型的鼠疫菌呈短而粗，中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌,菌體長約12 m，寬0.50.7 m 。有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。 由于涂片材料來源不同，形態(tài)特點亦不同。 用染疫動物或鼠疫患者及其尸體的新鮮材料所做涂片，一般可見到典型菌體形態(tài)，常散在，或成雙排列，或呈群聚，偶見有短鏈狀排列。 用瓊脂培養(yǎng)物制備的涂片標本，鼠疫桿菌呈球桿狀，著色比較均勻，兩極濃染不明顯或無兩極濃染。用肉湯培養(yǎng)物涂片，可見呈散在或者

2、短鏈狀排列的兩端鈍圓，兩極濃染的小桿菌。 鼠疫菌在跳蚤消化道內(nèi)的形態(tài)常發(fā)生變化，常呈近似球狀的卵圓形的球桿菌，有時也呈現(xiàn)兩端濃染。 陳舊性病灶、腐敗材料或在外界環(huán)境中生長的鼠疫菌可有多形性變化，這一特性應在鏡檢過程中應引起足夠的注意。 （二）（二） 培養(yǎng)特性：培養(yǎng)特性： 鼠疫菌為典型的異養(yǎng)菌，生長時需要多種有機物作為營養(yǎng)物質(zhì)，不過普通培養(yǎng)基就能滿足鼠疫菌的生長。 鼠疫菌為需氧菌，也能在厭氧條件下生長，但適量供氧生長最好，氧壓過高反而對生長有害。在厭氧環(huán)境生長時，發(fā)育緩慢且常出現(xiàn)變形。 鼠疫菌最適生長溫度為2830，在此溫度下培育的菌落表面干燥，易于用白金耳從培養(yǎng)基表面刮取，也較容易均勻地懸浮在

3、生理鹽水中。在37條件下生長緩慢，培養(yǎng)出的菌落表面濕潤、粘稠，不易刮取，不易制成均勻菌懸液。 培養(yǎng)基的最適pH值為6.97.1，但是pH值在5.88.0范圍內(nèi)鼠疫菌均可發(fā)育。 鼠疫菌雖然在普通培養(yǎng)基上生長良好，但是發(fā)育緩慢，一般需要2448小時才能形成肉眼可見的灰白色小菌落，如果培養(yǎng)基質(zhì)量差或者接種菌量過少，發(fā)育至成熟菌落的時間將會更長。 鼠疫菌在普通培養(yǎng)基上的發(fā)育，其群體形態(tài)具有一定的穩(wěn)定性，在最適溫度條件下在普通培養(yǎng)基上經(jīng)1618小時培養(yǎng)可見形狀不一，呈碎玻璃樣小菌落，2448小時后形成肉眼可見灰白色小菌落。在顯微鏡下，成熟的菌落中心發(fā)暗、突起，有黃褐色粗糙顆粒，菌落周邊圍繞一圈寬窄不等、

4、邊緣不整、薄而透明的鋸齒狀花邊。鼠疫菌的這一發(fā)育過程及成熟菌落的形態(tài)特點，是細菌學診斷的重要依據(jù)。 二、鼠疫檢驗材料的采集、保存和運輸二、鼠疫檢驗材料的采集、保存和運輸 （一）（一）鼠疫檢驗材料的采集鼠疫檢驗材料的采集： 1.1.人體標本材料的采集人體標本材料的采集：凡疑似鼠疫患者，應爭取在服用抗菌藥物前采取被檢材料標本，各型鼠疫患者除采靜脈血液35 ml供細菌學及血清學檢驗用外，可按臨床類型采取以下檢驗材料標本. 1.1 1.1 疑似鼠疫患者和密切接者的取材疑似鼠疫患者和密切接者的取材： （1 1）疑似腺鼠疫患者）疑似腺鼠疫患者： 選取腫大淋巴結(jié)，局部皮膚經(jīng)碘酒、酒精消毒后用注射器刺入腺體中

5、央，抽取適量組織液，保存于滅菌試管中或直接培養(yǎng)在斜面或平板上； 如腺腫過小取組織液困難，可用無菌注射器抽取0.30.5ml滅菌生理鹽水注入腺腫內(nèi)，停留片刻后，再緩慢抽取液體； 如腺腫開放或有波動感，應在腺腫周圍浸潤部位穿刺抽取組織滲出液。 （2）疑似肺鼠疫患者: 疑似鼠疫患者如有咳痰時，應用無菌試管、平皿或廣口瓶收集痰液； 患者無痰時用無菌棉簽取咽喉分泌物裝入無菌試管內(nèi)送檢。 （3）疑似敗血型鼠疫患者:該型患者除采靜脈血1 ml以上保存于無菌試管送檢外，還應采集咽喉分泌物進行檢驗。 1.2 1.2 密切接觸者取材密切接觸者取材:一般采用滅菌棉簽自咽喉部取材檢查，同時可采取淋巴穿刺液。 1.3

6、1.3 疑似鼠疫尸體的取材疑似鼠疫尸體的取材:經(jīng)流行病學調(diào)查和臨床檢查，不能排除鼠疫的尸體應以細菌學檢查作為最后診斷，取材方法以解剖取材為主，不能解剖取材的可行局部解剖取材或穿刺取材。取材時注意以下事項： （1）取材前應準備好取材的所有器械、試劑和容器等，如剪刀、鑷子、手術(shù)刀、骨鉗、穿刺針、注射器、生理鹽水、酒精、滅菌廣口瓶、試管等。以及消毒處理、個人防護的器械和藥品等； （2）取材應選取病變損害最明顯的部分采集。肝、脾、肺分別置于滅菌廣口瓶中，心血置于滅菌試管中；取口腔和鼻腔分泌物于滅菌試管中；若尸體已腐敗，可取股骨、脛骨、胸骨、肋骨骨髓。 （3）如不能進行尸體解剖時，可行局部取材?？稍谑w

7、的肝、脾、肺相應部位做局部小切口，采集相應的組織材料； （4）對鼠疫尸體在不能進行解剖取材時，也可行穿刺取材。方法是將要行取材的淋巴腺、肝、脾、肺、心等臟器組織部位皮膚經(jīng)局部70%酒精消毒后，用腰椎穿刺針抽取淋巴腺、肝、脾、肺、心等臟器組織液和心血，分別保存?zhèn)錂z。若尸體腐敗時，則應從胸骨柄或髂骨抽取骨髓液送檢。 2 2 動物標本材料的采集動物標本材料的采集: :動物標本材料取材前必須做詳細登記，主要記錄動物名稱、捕獲地點、捕獲時間、捕獲數(shù)量和采集者等信息數(shù)據(jù)。取材時可根據(jù)標本的類型采取相應的方法。 2.1 2.1 病、死動物的取材病、死動物的取材:病、死動物標本取材的原則是按先皮下、后胸腔、最

8、后腹腔的順序進行取材，并在取材時觀察皮下淋巴結(jié)及各臟器的病理變化。取材注意以下事項： （1）用3%來蘇爾液消毒解剖部位的皮毛，但不宜過濕，以免來蘇爾液進入體內(nèi)，影響檢驗結(jié)果； （2）取材時應選取病變明顯處取材，主要是腹股溝腫大的淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟和心血等。 （3）若臟器腐敗或殘缺不全，則應取骨髓檢驗，其方法 是剝?nèi)ス峭饧∪猓儆镁凭薨缓笤诮晒穷^端用骨鉗剪斷，以接種針取紅骨髓檢查。如骨髓已干枯，可用滅菌注射器注入少許生理鹽水抽取之，或?qū)⒘硪欢舜蜷_，用生理鹽水直接沖入平皿內(nèi)培養(yǎng)。 （4）取材時注意每取完一個臟器后均應將剪刀、鑷子經(jīng)來蘇爾棉塊、清水棉塊、干棉塊一一擦拭干凈，用火焰灼燒

9、，最后沾酒精過火焰冷卻后備用； （5）病、死動物的材料應采取兩份，一份自檢，一份送自治區(qū)疾控中心鼠防科復檢。 2.2 2.2 活體動物的取材活體動物的取材：捕獲活體動物原則上只采取肝、脾或有病變的組織進行檢查。每份材料需獨立存放于滅菌小瓶內(nèi)。 2.3 2.3 昆蟲材料的采集昆蟲材料的采集：可進行鼠疫檢驗的昆蟲材料包括：蚤類、蜱類、螨類、吸虱等，其中以蚤類為重點。在進行昆蟲標本材料采集時需注意以下事項： （1）宿主動物要單只裝袋，并注明采集時間、地點、宿主名稱和生境等。 （2）同體或同穴的昆蟲在分類鑒定后，分組或單只揀入裝有蚤類保存液1/20萬龍膽紫2%鹽水的小瓶內(nèi)送檢。 （二）鼠疫檢驗材料的保

10、存（二）鼠疫檢驗材料的保存 鼠疫材料的檢驗應遵循就近檢驗的原則，但在無條件時，應采取以下方法妥善保存檢驗材料。 1 1 組織塊的保存組織塊的保存： （1）將組織塊保存于生理鹽水中，用石蠟密封容器，可保存幾日。 （2）將組織塊保存于中性甘油保存液（中性甘油20 ml，蒸餾水80 ml，碳酸鈣2g）。將12 cm3的臟器小塊放入510 ml上述保存液中，可保存數(shù)日。 （3）野外采集臟器材料時常將組織塊放入中性油脂保存液（液體石蠟1份；羊毛脂1.5份；凡士林或固體石蠟1份）。加熱混勻后，置小廣口瓶中高壓滅菌后備用。 操作時應注意先將保存液溶化，待溫度降至不燙手時（約4045）倒入放置臟器塊的小瓶內(nèi)，

11、保存液應將臟器塊完全覆蓋。該保存液在低溫下保存時限不應超過一周。 2 2 蚤類標本的保存蚤類標本的保存： （1）活蚤的保存：將活蚤置于清潔的試管或小瓶中，用白布封好瓶口。并放入幾片無味的綠草，管底放少許干沙或干燥的濾紙塊（厚度約1 cm）置于陰暗處，避免接觸消毒液及有毒氣體。 （2）保存液法：將蚤放入1/20萬龍膽紫鹽水中保存，（配方為2%氯化鈉100 ml中加入1:1 000龍膽紫液0.5 ml）。 （三）（三）檢驗檢驗標本（菌種）的包裝與運輸標本（菌種）的包裝與運輸 1）準確詳細填寫送檢單。應包括：標本（菌種）種類、標本（菌種）數(shù)量、采集地點、采集時間、采取標本名稱、采集者、送檢者、菌種檢

12、驗者、菌種檢驗時間、送檢單位等。 2）按照國家生物安全的相關(guān)規(guī)定，將裝有材料的容器（試管、小瓶等）用石蠟或膠布密封，外裹以塑料布，再用浸有消毒液的棉花包裹后裝入特制的容器內(nèi)并附上詳細送檢報告單，指派2名人員（其中1名為專業(yè)人員）用當?shù)刈羁斓慕煌üぞ哌\送。 三、鼠疫病原學檢驗三、鼠疫病原學檢驗 （一）鼠疫細菌學檢驗和鑒定程序 常規(guī)的鼠疫病原體檢驗包括：菌體形態(tài)檢查、細菌培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解試驗和動物試驗四步，通稱“四步檢驗”。 鼠疫菌體形態(tài)檢查鼠疫菌體形態(tài)檢查 1 1 涂片涂片 在收集到檢驗材料之后要盡快地涂片，剪取腺體、肝、脾、肺、心，用臟器切面在潔凈載玻片上壓印，或取骨髓、腦脊液及各種滲出液

13、、痰等用接種環(huán)直接涂片，或挑取可疑菌落用生理鹽水研磨涂片。 2 2 固定固定 在緊急情況下，允許加熱固定，但如果用甲醇（或95%酒精或95%酒精和乙醚各半）固定，可以促進鼠疫菌兩端濃染效果更好，并能殺死鼠疫菌。將可疑鼠疫材料涂抹在載玻片上，晾干或制成壓印涂片，浸在固定液中，固定510分鐘，取出晾干染色。 3 3 染色染色 分別用革蘭氏染液、美蘭染液進行染色。 1）革蘭氏染色革蘭氏染色 將結(jié)晶紫染液加于已固定的標本上，染1分鐘； 水洗后用盧戈氏碘液染1分鐘； 水洗后用95%酒精脫色約0.51分鐘，將玻片輕輕搖動直到無紫色繼續(xù)脫落為止； 水洗后用稀釋石碳酸復紅復染1分鐘，水洗待干。 2）美蘭染色美

14、蘭染色 將染液加在已固定的涂片上，染35分鐘，然后再水洗，待干，鏡檢。 4 鏡檢鏡檢 在顯微鏡下，查找典型鼠疫菌，即兩端鈍園、兩極濃染、卵園形，革蘭氏陰性小桿菌（菌體長12um,寬0.50.7um）。顯微鏡標本對鼠疫菌的鑒別診斷有一定幫助，僅根據(jù)鼠疫菌的形態(tài)，不能做最后確診。 細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng) 鼠疫菌培養(yǎng)可根據(jù)待檢標本的種類和新鮮程度選用不同的培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，腐敗材料最好經(jīng)皮感染實驗動物，待接種動物死亡或7日處死后取材培養(yǎng)。 1 1 培養(yǎng)基培養(yǎng)基:培養(yǎng)基是細菌培養(yǎng)獲得準確結(jié)果的基礎,必須在營養(yǎng)成分、酸堿度、透明度及高壓滅菌等方面嚴格把關(guān)。并進行質(zhì)量控制。 細菌學監(jiān)測中常用培養(yǎng)基有： 1 1

15、）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基： 一般市場有售，按說明溶解于蒸餾水中，按一定量分裝克氏瓶內(nèi)，15磅30 min高壓滅菌后倒制平板備用。 2 2）LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基： 胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉 5 g、瓊脂粉6 g（不同生產(chǎn)廠家的瓊脂粉加量不同，需做預試驗確定加入量）、蒸餾水1 000ml。 制備時將所有成分加熱溶解，用1 N氫氧化鈉將pH調(diào)至7.2；分裝克氏瓶內(nèi)，每瓶約300 ml； 15磅30 min高壓滅菌；待克氏瓶中培養(yǎng)基冷卻至50左右，無菌條件下倒制平板，每個平板倒入約15 ml，分離細菌時使用。 3 3）瓊脂斜面）瓊脂斜面：將上述溶化好的瓊脂培基分裝量為試管的1/5

16、，15磅30 min高壓滅菌后，取出趁熱擺放制成斜面，斜面長度約為試管長度的1/3。 4 4）瓊脂高層：）瓊脂高層：將上述溶化好的瓊脂培基分裝量為試管的1/3， 15磅30 min高壓滅菌后，取出豎直擺放冷卻備用。 2 2 取材和接種取材和接種 培養(yǎng)前取材的器械消毒應按以下順序進行: 剪刀、鑷子等先用浸有來蘇爾液的棉球擦試清水棉球擦干棉球擦干過火焰浸入95%酒精中取出過火焰，冷卻后取材。每取完一個臟器，剪刀、鑷子等都需重新嚴格消毒。 1 1）疑似患者的材料疑似患者的材料: 淋巴腺穿刺液：在含菌量高時，用白金耳劃線培養(yǎng)，如已用生理鹽水稀釋的穿刺液，則必須充分振蕩，然后用白金耳做劃線培養(yǎng)?；蛴妹?/p>

17、管滴于培養(yǎng)基表面12滴，再用白金耳劃線。 痰：痰的培養(yǎng)以稀釋培養(yǎng)法較宜。用棉簽采取的咽喉分泌物可直接涂于培養(yǎng)基。 血液：直接培養(yǎng)。將1 ml血液加入5 ml肉湯內(nèi)，培養(yǎng)24小時后，再用白金耳取出，培養(yǎng)在平板上。 膿汁：培養(yǎng)法同痰液。 2 2）尸體材料）尸體材料: 臟器：根據(jù)不同的臟器材料，采取不同的培養(yǎng)方法，并做好詳細標記。 用滅菌剪刀剪下一小塊臟器材料，以鑷子夾住，直接點于培養(yǎng)基靠邊處,然后用白金耳劃線。 骨髓：一般以接種針采取骨髓，直接劃線培養(yǎng)。 3 3）病死鼠臟器材料）病死鼠臟器材料: 培養(yǎng)的原則是單只培養(yǎng)、單只接種。 將新鮮臟器切面直接點種于瓊脂平板靠邊處，然后用白金耳劃線培養(yǎng)。點種后

18、的臟器制成懸液接種試驗動物。對于較腐敗的死鼠臟器，可直接用白金耳從臟器切面上取材劃線培養(yǎng)，或通過小白鼠后再進行細菌培養(yǎng)。 4 4）捕獲活鼠臟器材料）捕獲活鼠臟器材料： 培養(yǎng)原則是單只培養(yǎng)，集組接種，每組 10只。 一般情況下只取肝、脾檢驗，每兩只鼠臟器，分別培養(yǎng)于1個平皿上。按同一時間、同一地點捕獲的同種動物培養(yǎng)后可分組進行動物試驗，但每組一般不得超過10只，小型嚙齒動物不得超過15只。 5 5）蚤、蜱等昆蟲材料）蚤、蜱等昆蟲材料： 病死鼠體蚤均需單只檢菌，將蚤體放入滅菌的凹玻璃板上，用生理鹽水冼3次，將后胸背板和第一腹節(jié)剝開，用解剖針固定肛門前方，再用另一解剖針從頭部刺入，拉出蚤胃，用滅菌白

19、金耳在板上將胃磨破，接種于培養(yǎng)基上。 3 3 培養(yǎng)培養(yǎng) 鼠疫菌的最適培養(yǎng)溫度為28，培養(yǎng)的動物材料連續(xù)觀察3天，病死材料及蚤類材料連續(xù)觀察5天，3天或5天不生長即可處理。 值得注意的是，野外實驗室應隨時觀察孵箱溫度的變化，始終保持在2830之間。 4 4 結(jié)果觀察結(jié)果觀察 培養(yǎng)2448小時后肉眼可見菌落形成，直徑約0.10.2 mm,中央突起半透明淡灰色小菌落.鏡下菌落中央呈黃褐色,有粗糙顆粒,邊緣薄呈半透明有鋸齒狀花邊。 將具有上述特點的菌落挑選出來進一步做鼠疫噬菌體試驗。菌落觀察必須仔細認真，肉眼初篩后，應勾畫出可疑菌在鏡下進一步觀察確認，不得輕意丟棄。 鼠疫噬菌體裂解試驗鼠疫噬菌體裂解試

20、驗 鼠疫噬菌體裂解試驗是鼠疫細菌學診斷中較特異的診斷方法。 培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)的可疑菌落，用白金耳勾出移種在另一個瓊脂平皿上，接種劃線要密。然后用注射器滴加1滴鼠疫噬菌體于劃線部位起點中心部分，合起平板并傾斜使噬菌體流線與培養(yǎng)劃線垂直交叉流下，放入28溫箱中，次日觀察結(jié)果。如出現(xiàn)噬菌帶則判為鼠疫噬菌體裂解試驗陽性。即可判定為鼠疫菌。 一般做培養(yǎng)檢查的同時做噬菌體裂解試驗。即同時接種兩個瓊脂平皿，一個做培養(yǎng)檢查，另一個做鼠疫噬菌體裂解試驗。 操作中應注意以下幾點：操作中應注意以下幾點： 1）疫噬菌體必須保持足夠的效價（一般是10-8）效價降低到一定程度，則噬菌帶不明顯，噬菌體失效則不出現(xiàn)噬菌斑，造成錯誤

21、的判斷。 2）使用噬菌體前需觀察有無污染，如有污染不得使用。 3）操作要規(guī)范，滴加噬菌體時，必須讓噬菌體液自然流下。 4）真假陽性的區(qū)別： 陽性：噬菌帶中間無鼠疫菌生長，噬菌帶邊緣在顯微鏡下有被侵噬的斑紋噬菌帶逐漸擴展，擴展后兩邊有形象模糊的邊緣。 假陽性：噬菌體流道中間有與培養(yǎng)菌相同的菌落，流道邊緣菌落或菌苔完整，由于細菌生長，流道逐漸縮小或不明顯 。 動物試驗動物試驗 動物試驗在鼠疫細菌學檢查中有2種目的。一種目的是材料含菌量少或材料腐敗，培養(yǎng)不易獲得陽性結(jié)果時，以敏感動物體培養(yǎng)，同時也為了觀察細菌對動物的致病性和病理變化；另一種目的是菌株已經(jīng)分離出來，為了測定該菌株毒力的強弱，或者為了增

22、強菌株的毒力，而作動物試驗。 試驗動物常用小白鼠（18-20g）和豚鼠（250-300g），而以豚鼠最好，因小白鼠對鼠疫菌的毒素較敏感且在夏季死亡后極易腐敗，分離鼠疫菌較困難。 1 1 被檢懸液的制備被檢懸液的制備： （1）臟器：將所取臟器塊放入已消毒好的乳缽中剪碎研磨后，按1:10的比例加入生理鹽水，為了便于注射器吸取臟器懸液，可在臟器懸液中加一小塊滅菌脫脂棉。 （2）昆蟲：將已分類好的蚤、蜱從保存液取出，用滅菌鹽水反復沖洗數(shù)次，然后研磨制成懸液，接種動物；當檢獲大量蚤類時，可按地區(qū)、宿主、蚤種進行分組，每組30只。 2 2 接種方法接種方法： 根據(jù)不同目的、被檢材料新鮮及腐敗程度來決定接種

23、方法。 （1）腹腔接種：一般新鮮材料和純培養(yǎng)的菌液，為了迅速獲取陽性結(jié)果而又不期待它出現(xiàn)較完全的病理變化時多用腹腔接種。 將腹部皮膚注射部位剪毛，經(jīng)消毒后提起腹部，將被檢懸液注入腹腔，注意不得損傷內(nèi)臟器官。接種量為小白鼠每只0.20.4ml，豚鼠每只接種0.50.6ml。 （2）經(jīng)皮接種：這種方法多用于腐敗或污染程度嚴重的材料。將小白鼠或豚鼠腹部毛剪去一小塊，用刀刮至有出血點后，將待檢材料以棉拭子涂布于已刮過的皮上并反復揉擦，使液體充分浸入。 （3）皮下接種：材料不太腐敗時此方法較好，一般病程短，病理變化較明顯。是動物接種最常用的方法。 試驗動物鼠蹊部經(jīng)消毒后將被檢懸液注入皮下，接種劑量同腹腔

24、接種法。 一般每份材料接種兩只小白鼠，按材料的新鮮與腐敗的不同程度常采取兩種不同途徑進行接種。如材料新鮮可采用皮下、腹腔各一只，如果材料腐敗，則可采取皮下、經(jīng)皮各接種一只。 3 3 飼養(yǎng)與結(jié)果觀察飼養(yǎng)與結(jié)果觀察: : （1）實驗動物接種后，放入飼養(yǎng)盒內(nèi)，詳細記錄編號、接種日期等，每日觀察12次，直至動物死亡或57天觀察期滿，處死剖檢。同時應注意感染動物死亡后，飼養(yǎng)盒的清洗與消毒。 （2）鼠疫材料的實驗動物，一般13天發(fā)?。òY狀為不攝食，豎毛尤以背部為明顯衰弱），37日死亡。動物死亡后應迅速解剖，觀察病理變化并做培養(yǎng)及噬菌體裂解試驗。必要時可進行動物傳代。 感染34天死亡的動物，解剖時常見急性鼠

25、疫特有的病理變化，皮下血管充血，肝、脾有微小病死灶，充血并腫大，肺充血，心血不凝，皮下注射部位可見出血性浸潤，注射部位淋巴結(jié)腫大。 （二）鼠疫菌的判定依據(jù)及鑒定：（二）鼠疫菌的判定依據(jù)及鑒定： （1）形態(tài)特征與染色特征與鼠疫菌相符。（2）培養(yǎng)特征與鼠疫菌一致。（3）被鼠疫噬菌體裂解，但應注意排除假噬菌現(xiàn)象，該項指標為判定鼠疫菌的主要依據(jù)。（4）實驗感染的小白鼠或豚鼠，具有鼠疫特有的病理改變，并從實驗動物體內(nèi)分離出鼠疫菌。 （三）結(jié)果報告（三）結(jié)果報告： 判定為鼠疫菌時，除通知送檢單位以便及時采取防治措施外，應立即以書面形式連同兩只試管培養(yǎng)物，按照衛(wèi)生部可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或

26、樣本運輸管理規(guī)定進行包裝和運輸，派專人專車上送省級專業(yè)機構(gòu)作復查判定。 上報內(nèi)容包括：被檢材料的種類、數(shù)量、來源、時間、送檢者、收到時間、檢驗者（單位、姓名并蓋章）主要判定依據(jù)。培養(yǎng)物在送檢同時要留一份備查，待作出最終判定后再行銷毀或上送。 鼠疫實驗室及其管理和運行鼠疫實驗室及其管理和運行 按照中國的病原微生物實驗室生物安全管理條例（國務院令424號）和實驗室生物通用要求（GB19589-2004）的規(guī)定，鼠疫病原微生物操作實驗室應具備國家二級生物安全水平（BSL-2）。 （一）基本要求（一）基本要求 1 鼠疫細菌學檢驗必須在專用的BSL-2實驗室內(nèi)進行。 2 檢驗人員必熟悉并遵守BSL-2實

27、驗室工作制度、自身防護規(guī)則及有關(guān)技術(shù)操作規(guī)程。 3.凡進入毒菌室操作，必須2人以上同時工作。及時準確做好檢驗的各項實驗記錄。 4.實驗室管理實行人員準入和使用審批制度。 5.實驗室工作人員，實行資格證書和準入制度，符合規(guī)定資質(zhì)的人員經(jīng)生物安全崗前培訓，考試合格，獲得崗位資質(zhì)證書；并簽定生物安全責任書后方可辦理準入手續(xù)。 （二）（二） 生物安全實驗室的建立和要求生物安全實驗室的建立和要求 生物安全實驗室是進行病原微生物分離、培養(yǎng)、鑒定和保存的專用實驗室，它可以保證工作人員自身安全、防止環(huán)境污染的意外事故發(fā)生，提高疾病控制機構(gòu)抗御事故的能力。 完整的生物安全實驗室由以下三部分構(gòu)成： （1）生物安全

28、實驗室設施、設備和個人防護裝備； （2）有一定數(shù)量的、經(jīng)正規(guī)培訓的技術(shù)人員； （3）綜合的生物安全管理手冊、標準操作程序。 實驗室的設施要求：實驗室的設施要求： 實驗室生物安全防護屏障實驗室生物安全防護屏障： 級生物安全防護水平（BSL-1）：級生物安全水平是指實驗室操作、安全設施適應于從事明確生物學特征的、已知在健康成人中不引起疾病的、活的微生物菌（毒）株的實驗活動要求達到的水平。 級生物安全防護水平（級生物安全防護水平（BSL-2BSL-2）：標準的BSL-2實驗室除了滿足BSL-1的要求以外，在門上增加生物危險標志、級生物安全柜、高壓蒸汽滅菌器、安全離心機罩帽、防濺罩或眼罩、冼眼器等。

29、1 1）使用設計原則）使用設計原則： 必須為實驗室安全運行、清潔和維護提供足夠的空間。應設有各自獨立的個人辦公室、輔助實驗室（存儲與實驗準備間）、操作實驗室。 實驗室門應帶鎖并可自動關(guān)閉。實驗室門應有可視窗，門口應設有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設施。門上貼有符合要求的BSL-2實驗室危險標志。如應用窗戶自然通風，應有防蟲紗窗。 每個實驗室的墻壁、天花板和地面應平整、易清潔、不滲水、耐化學藥品和消毒劑的腐蝕。地面應防滑，不得鋪地毯。 實驗臺應防水，耐腐蝕、耐熱。實驗室中的廚柜和實驗臺應牢固。廚柜、實驗臺之間應保持一定距離，以便于清潔。 在實驗室門口應設有掛衣裝置，個人便裝與實驗室工作服分開放置

30、。在實驗室內(nèi)應穿專門工作服；戴乳膠手套。 實驗室應保證工作照明，避免不必要的反光和強光。 有可靠的電力供應和應急照明。必要時，重要設備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等應設專用電源。 應在實驗室內(nèi)配備生物安全柜，生物安全柜應安裝于人走動少的地方，不應安裝在門口。生物安全柜的背面、側(cè)面與墻壁之間的距離宜保持不小于150300 mm的檢修距離，頂部也應留有不小于300 mm的空間。 應有適當?shù)南驹O備，在靠近實驗室的位置配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗證，以保證符合要求。 2 2）縣級）縣級BSL-2BSL-2建設要求：建設要求： 設施要求：要滿足上述通用要求，可在公用實驗室區(qū)域選取足夠的房間，一間作

31、為工作人員的辦公室兼作個人物品存放和倉儲,按進入次序依次為準備間，面積適宜；最后是操作感染性材料的實驗室，面積30 km2左右為宜（詳見通用要求）。 裝備要求：有條件的在BSL-1和BSL-2實驗室都應設置通風廚或負壓罩，用作有害氣體、化學物操作；必須安裝生物安全柜，用于操作感染性材料中容易產(chǎn)生氣溶膠和噴濺的操作。建議選用CLASS級安全柜，符合國際分級標準；配備高壓蒸汽滅菌器和生化培養(yǎng)箱。 （三）（三） 鼠疫鼠疫BSL-2BSL-2實驗室的管理實驗室的管理 1、生物安全管理 (1)實驗室主任（對實驗室直接負責的人員）負責制訂和采用生物安全管理計劃以及安全或操作手冊。 (2)實驗室主管（向?qū)嶒?/p>

32、室主任匯報）應當保證提供常規(guī)的實驗室安全培訓。(3)要將生物安全實驗室的特殊危害告知實驗室人員，同時要求他們閱讀生物安全或操作手冊，并遵循標準的操作和規(guī)程。實驗室主管應當確保所有實驗室人員都了解這些要求。實驗室內(nèi)應備有可供取閱安全或操作手冊。(4)應當制訂節(jié)肢動物和嚙齒動物的控制方案。(5)如有必要，應為所有實驗室人員提供適宜的醫(yī)學評估、監(jiān)測和治療，并應妥善保存相應的醫(yī)學記錄。 2、實驗室管理 （1）實驗室應保持清潔整齊，嚴禁擺放和實驗無關(guān)的的物品。 （2）發(fā)生具有潛在危險性的材料溢出以及在每天工作結(jié)束之后，都必須清除工作臺面的污染。所有受到污染的材料、標本和培養(yǎng)物在廢棄和清潔再利用之前，必須

33、清除污染。 （3）認真做好實驗記錄，特別做好各種儀器設備運行記錄。 （4）各種儀器、設備要經(jīng)過有資格的計量部門的鑒定，并有標志。 （5）妥善保管易燃、易爆的有害化學物和氣體，對其操作時要在通風柜內(nèi)進行。 （6）按要求做好水電的管理和安全。 （四）（四） 實驗室操作規(guī)范實驗室操作規(guī)范 從事鼠疫微生物的操作，都應遵循下列基本原則： （1）所有操作人員必須經(jīng)過專業(yè)技術(shù)培訓，經(jīng)考核批準才能工作。 （2）熟悉各種儀器的操作步驟和要點，進行正確的操作和使用。 （3）應掌握各種感染性物質(zhì)操作的一般準則和技術(shù)要點。嚴格按照鼠疫操作手冊進行操作。 （五）鼠疫強毒實驗室操作規(guī)程（五）鼠疫強毒實驗室操作規(guī)程 1、凡

34、是鼠疫材料、疑似材料的檢驗或鑒定等項工作必 須在鼠疫強毒實驗室內(nèi)進行。 2、鼠疫強毒實驗室操作，需有2名工作人員同時進入。 3、強毒區(qū)工作前，用紫外燈照射半小時消毒工作區(qū)域。 4、工作人員按要求著裝，才能進入強毒區(qū)域。 5、進入實驗室（1）進入實驗室時，每進入一道門，應先將此門關(guān)好，再開啟下一道門。（2）實驗過程中所需要的其它物品應從傳遞窗送入。（3）進入實驗室后，關(guān)閉紫外燈。（4）做好開始實驗的各項準備。6、實驗操作1）凡是鼠疫材料及疑似材料的檢驗或鑒定，包括菌種開封、細菌分離、培養(yǎng)或其它操作，均應在實驗室生物安全柜內(nèi)進行。2）在進行實驗工作之前，工作臺面先用消毒液滅菌并鋪放浸有消毒液的毛巾

35、，隨時進行工作臺面的消毒。3）進行細菌操作時，使用一次性接種環(huán)或使用接種環(huán)電熱滅菌器燃燒滅菌接種環(huán)，避免菌液或菌塊飛濺。4）稀釋菌液時，將吸管插入試管或燒瓶底部，用吸球緩慢打擊菌液，避免產(chǎn)生氣泡。5）實驗中需使用酚、氯仿等腐蝕性試劑時，應在乳膠套外 加戴一次性塑料手套。 6） 離心時，應使用雙蓋封閉式離心機和全封閉試管，每管離心液總量至少低于最高容量1個刻度單位；平衡時不得有菌液滲漏到套管中，離心機使用后立即用消毒液擦洗消毒。 7） 進行實驗操作時，勿用手直接對接或拔開注射器和針頭 ，以免劃破皮膚或無意接種。 8）禁止在空氣中直接排放含有菌液注射器內(nèi)的氣泡，以免 形成氣溶膠。 9） 實驗中使用

36、的利器，應用利器盒直接收集處理。 10）接種了強毒鼠疫菌的動物必須飼養(yǎng)在封閉的實驗動物室內(nèi)，并有明確的實驗記錄11）未分離到鼠疫菌的動物尸體必須在實驗室內(nèi)用5%來蘇兒浸泡5晝夜，然后深坑掩埋。染疫動物尸體必須5%來蘇兒浸泡后，再高壓滅菌后深埋。12）工作完畢，檢查各儀器設備是否恢復零位，做好使 用記錄。13）實驗操作結(jié)束后，用消毒液消毒、清理工作臺面、地面等，并詳細記錄所做的工作內(nèi)容。 7、出實驗室及脫個人防護裝備。 1）先用消毒液浸泡手套、長筒膠靴5分鐘。 2）用噴霧器從上至下噴霧消毒防護服。 3）脫個人防護裝備并按要求進行消毒滅菌。 4）最后使用75%酒精對手部、面部及暴露部位擦拭消毒，用

37、3%硼酸水漱口后離開實驗室。 8、關(guān)閉實驗室，打開實驗室紫外燈進行30分鐘消毒。 （六）實驗室操作防護和個人防護：（六）實驗室操作防護和個人防護： 1 1、實驗室操作防護、實驗室操作防護 （1）進行實驗室操作，任何時候都必須戴口罩和防護眼鏡、穿著反背隔離防護服，穿防護鞋襪，不得裸露腿部和腳趾，必要時穿連體衣。 （2）在進行可能直接或意外接觸到血液、體液以及其他具有潛在感染性的材料或感染性動物的操作時，應戴上合適的手套。手套用完后，先消毒再摘除，隨后必須洗手。 （3）在處理完感染性實驗材料和動物后，以及在離開實驗室工作區(qū)域前，都必須洗手。 （4）為了防止眼睛或面部受到灑濺物、碰撞物或人工紫外線輻

38、射的傷害，必須戴安全眼鏡，必要時戴面罩（面具）或其他防護裝備。 （5）嚴禁穿著實驗室防護裝備離開（如去餐廳、辦公室、圖書館、員工休息室和衛(wèi)生間等），更不能把防護器材帶回家。 （6）禁止在實驗室的準備間和操作間里進食、飲水、吸煙、化妝、處理隱形眼鏡和儲存食品和飲料。 （7）在實驗室內(nèi)用過的防護服要消毒后再清洗，不得和日常服裝放在同一柜子內(nèi)。 2 2 個人防護除符合個人防護除符合BSLBSL2 2的要求外，還應該符合下列條的要求外，還應該符合下列條件：件： （1）工作人員在進入實驗室時必須使用個體防護裝備，包括兩層防護服、兩層手套、生物安全專業(yè)防護口罩（不應使用醫(yī)用外科口罩等），必要時佩戴眼罩、呼

39、吸保護裝置等。工作完畢必須脫下工作服，不得穿工作服離開實驗室?？稍俅问褂玫墓ぷ鞣仨毾认竞笄逑?。 （2）在實驗室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用。實驗室區(qū)域內(nèi)應配備應急藥品。 （3）個人防護用品的穿脫順序 穿脫順序應根據(jù)使用的防護服而定，一般原則是先穿后脫，后穿先脫，嚴格區(qū)分潔凈品和污染品。（1）穿防護用品順序：穿內(nèi)防護衣、褲-穿靴套-穿膠靴-戴帽子-戴口罩-戴手套-戴猴帽 -穿外防護衣-戴大口罩-戴手套-戴防護眼鏡或面罩。（2）脫防護用品順序：全身噴霧消毒-消毒液泡手-摘下防護眼鏡或面罩-脫外防護服-摘下大口罩-摘下猴帽- 摘外層手套- 摘帽子、口罩-脫膠靴-脫靴套

40、- 摘內(nèi)層手套-脫內(nèi)防護褲、衣-使用75%酒精對手部、面部及暴露部位擦拭消毒。 （七）實驗室消毒（七）實驗室消毒 1）鼠疫實驗室日常消毒要求1、實驗室應制定日常消毒制度，定期進行消毒處理，有專人負責檢查實驗室日常消毒情況。2、實驗室常備75酒精、實驗室消毒槽（池）、浸泡缸、噴霧器并備有足量500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的來蘇兒（或石炭酸）溶液供隨時消毒使用。 3、實驗室使用前后均應開啟紫外線消毒裝置進行空氣消毒，照射時間不低于30min。 4、進行細菌學檢驗操作時，用1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的來蘇兒溶液浸濕的毛巾鋪工作臺面，工作結(jié)束后，將毛巾和廢棄物置浸泡缸消毒后高壓

41、處理。用75酒精擦拭工作臺面，用500-1000mg/L二氧化氯溶液或3-5的來蘇兒溶液擦抹地面。如發(fā)生工作面污染，培養(yǎng)物濺落等情況，在污染部位噴灑消毒液，保持十分鐘，抹去消毒液，再以75%乙醇擦拭。5、鼠疫現(xiàn)場實驗室可以定期用甲醛熏蒸，密閉過夜，充分通風后使用。生物安全實驗室按規(guī)定操作。 2）實驗室消毒方法：）實驗室消毒方法： 1、人員卸裝消毒：在簡易和普通鼠疫強毒實驗室內(nèi)，工作結(jié)束后將手和腳（穿著膠靴和手套）在消毒液內(nèi)浸1-3分鐘，全身經(jīng)噴霧消毒,然后在消毒間按著裝相反順序脫下(手術(shù)手套在偏衫后脫)，可高壓的防護裝備經(jīng)高壓滅菌，面罩或眼鏡用75%酒精棉球消毒。最后洗手，用75%酒精棉球擦面部裸露部位,用3%硼酸水漱口后