旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性研究

1、旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性研究作者：王雪梅 張建勝 戴云 高云濤【摘要】目的研究旱蓮草總黃酮的提取及其抗氧化活性。方法利用Fentaon反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基OH，光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子自由基O-2，采用分光光度法研究旱蓮草體外清除活性氧自由基的作用，用硫代巴比妥酸（TBA）分光光度法研究其對(duì)OH誘發(fā)卵磷脂脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷的抑制作用。結(jié)果旱蓮草總黃酮得率為3.96%，對(duì)OH、O-2的半清除率IC50為0.015 mgml-1，0.08 mgml-1;對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化DNA氧化損傷的半抑制率為0.02 mgml-1，2.0 gml-1。結(jié)論旱蓮草總黃酮能有效清除活性氧自由基，對(duì)卵磷脂

2、脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷有顯著抑制作用。 【關(guān)鍵詞】旱蓮草； 總黃酮； 抗氧化Abstract：ObjectiveTo study the extraction of flavone from Eclipta alba and its antioxidation function.MethodsScavenging effects of Eclipta alba on active oxygen species OH and O-2 generated by Fenton reaction and riboflavine photosensitization were investigate

3、d by the means of spectrophotometry. The inhibitory effects of Eclipta alba on the lecithin lipid peroxidation and damage of DNA chain induced by hydroxyl radical were observed by thiobarbit uric acid spectrophotometry.ResultsTotal flavonoids in Eclipta alba was 3.96%; the semi-clearance rate of OH

4、and O-2was 0.015 mgml-1 and 0.08 mgml-1; the semi-inhibition rate of Lecithin lipid peroxidation and oxidation damage of DNA was 0.02 mgml-1 and 2.0 gml-1.ConclusionEclipta alba can scavenge active oxygen efficiently. It can also significantly inhibit lipid peroxidation and damage of DNA by hydroxyl

5、 radical.Key words：Eclipta alba; Flavone; Antioxidation旱蓮草Eclipta alba是菊科植物鱧腸Ecliptaprostratal L. 的干燥地上部分。各個(gè)不同的地區(qū)有許多別名,如墨旱蓮、水旱蓮、墨斗草等1。中醫(yī)用其滋補(bǔ)肝腎，涼血止血。 現(xiàn)代 藥理研究證明墨旱蓮具有止血、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗誘變以及抗菌抗炎等病癥2。在傣族傳統(tǒng)醫(yī)藥中，旱蓮草被稱(chēng)為皇舊，有 治療 風(fēng)濕麻木、痿軟偏癱、頭痛耳聾、尿路感染、各種出血、黃疸等作用。同時(shí)，旱蓮草在食用方面也有較廣泛的應(yīng)用,有“亦蔬亦藥”的說(shuō)法3。植物中的黃酮類(lèi)成分均有一定的抗氧化活性4，有研究報(bào)道

6、旱蓮草的黃酮類(lèi)成分具有免疫調(diào)節(jié)作用5，但關(guān)于旱蓮草黃酮類(lèi)成分的抗氧化活性研究目前鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)旱蓮草總黃酮的提取及其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。1 器材 旱蓮草（購(gòu)至當(dāng)?shù)刂兴幍辏它S素（VB2），氯化硝基四氮唑蘭（NBT）（購(gòu)至ChemBase公司），番紅花紅（Safranine T），蛋氨酸，鯡魚(yú)精DNA（購(gòu)至sigma公司），2-硫代巴比妥酸（TBA），三氯乙酸（TCA），無(wú)水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，石油醚，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。9200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋，低溫超速離心機(jī)，光照箱（自制，35 cm30 cm25 c

7、m，光源為純稀土節(jié)能燈，燈功率45 W）。2 方法 2.1 旱蓮草總黃酮成分的提取6稱(chēng)取旱蓮草粉末12 g，用20倍量的85 %的乙醇超聲浸提45 min，過(guò)濾，濾渣再用20倍量的85 %的乙醇超聲浸提45 min，過(guò)濾后合并兩次濾液，用石油醚萃取兩次，取下層液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，稱(chēng)重。將旱蓮草總黃酮初提物用甲醇溶解并定溶至100 ml備用。2.2 總黃酮含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.013 2 g，用70 %的乙醇溶解轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶(濃度為0.264 mgml-1)，精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 ml置于25 ml比色管中,用30 %乙

8、醇溶液補(bǔ)充至10 ml，加入5 %亞硝酸鈉溶液0.7 ml,搖勻,放置5 min后,加入10 % 硝酸鋁溶液0.7 ml，搖勻, 5 min后再加入1 molL-1氫氧化鈉溶液5 ml，搖勻，用30 %乙醇溶液稀釋至刻度,10 min后在510 nm處測(cè)定吸光度,以蒸餾水為空白參比。以蘆丁濃度對(duì)吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并 計(jì)算 回歸方程。吸取2 ml旱蓮草提取液于25 ml比色管中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法測(cè)定吸光度Y值,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程換算成濃度X(mgml-1)。2.3 旱蓮草總黃酮清除超氧陰離子自由基活性測(cè)定采用光照核黃素7的方法用 0.05 molL-1 pH = 7.4 的PBS緩

9、沖液為溶劑，配制1.67 10- 5 molL-1核黃素，0.01 molL-1 蛋氨酸，4. 610- 5molL-1氯化硝基四氮唑蘭(NBT) 。分別取上述3種溶液各2.0 ml，加入不同濃度的總黃酮提取液（樣品）溶液1.0 ml，空白管以1.0 ml緩沖液代替樣品溶液。置于光照箱中光照30 min，取出后以緩沖溶液為參比于560 nm處測(cè)定溶液的吸光度。清除率按下式計(jì)算。A0為空白管的吸光度。A樣為樣品管的吸光度。清除率（%）=A0-A樣A0100%2.4 旱蓮草總黃酮清除羥自由基活性測(cè)定采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥自由基（Fenton反應(yīng)），該反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可使番紅花紅褪色8。取

10、0.15 molL-1 pH 7.4的磷酸緩沖溶液1.0 ml，40 gml-1番紅花紅1.0 ml，0.945 mmolL-1 EDTA-Fe()（新鮮配制）1.0 ml，樣品溶液0.5 ml、3 %H2O21.0 ml（新鮮配制），混合后在37水浴中反應(yīng)30 min后在520 nm處測(cè)定吸光度As?？瞻捉M以0.5 ml蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0，對(duì)照組以1.5 ml蒸餾水代替H2O2和樣品測(cè)定吸光度A，用3.5 ml蒸餾水代替番紅花紅、EDTA-Fe()、H2O2、樣品，1.0 ml磷酸鹽緩沖溶液，調(diào)零。并按下式計(jì)算清除率。清除率（%）=As-A0A-A0100%2.5 旱蓮草總黃酮對(duì)脂

11、質(zhì)過(guò)氧化抑制活性的測(cè)定9取0.2 ml卵磷脂溶液（用300 mg 卵磷脂溶解于30 ml 10 mmolL-1 pH 7.4 PBS，冰浴振蕩），加入 pH 7.4 PBS緩沖液1.0 ml，不同濃度的樣品溶液0.5 ml，2.5 mmolL-1 EDTA-Fe() 1.0 ml，混勻后于37水浴中反應(yīng)45 min，再加入28 %（W/V）的TCA 2.0 ml，1 %（W/V）的TBA1.0 ml，混勻后置于100沸水浴中加熱10 min，冷卻后在532 nm處測(cè)定吸光度A樣，用PBS緩沖液調(diào)零，空白管用PBS緩沖液代替樣品測(cè)吸光度A0。并按下式計(jì)算抑制率。抑制率（%）=A0-A樣A0100

12、%2.6 OH引發(fā)DNA損傷抑制TBA法10，11取pH = 7.0 的Tris- HCl 緩沖溶液1.0 ml，4 mgml-1 DNA 0.2 ml，不同濃度的樣品溶液0.5 ml，25 mmolL-1 EDTA-Fe() 1.0 ml，3 %H2O21.0 ml（新鮮配制），在37水浴中恒溫1.5 h后，取出加入28 %（W/V）的TCA 2.0 ml，1 %（W/V）的TBA1.0 ml，混勻后置于100 沸水中加熱10 min，冷卻后于波長(zhǎng)532 nm處測(cè)吸光度A樣 。空白管以0.5 ml蒸餾水代替樣品測(cè)A0。用緩沖溶液作參比，抑制率按下式計(jì)算。抑制率（%）=A0-A樣A0100%3

13、 結(jié)果 3.1 旱蓮草總黃酮得率 計(jì)算 按前述方法,測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液的吸光度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線形回歸，得到蘆丁溶液濃度Y(mgml-1)與吸光度值X關(guān)系曲線的回歸方程式：Y = 6.186 7X-0.005 2，其相關(guān)系數(shù)R2 =0. 999 2。由回歸方程及樣品吸光度計(jì)算出樣品中黃酮的含量，計(jì)算總黃酮得率為3.96 %。3.2 旱蓮草總黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用在蛋氨酸存在的情況下對(duì)核黃素進(jìn)行光照可產(chǎn)生超氧陰離子自由基，在反應(yīng)體系中加入氯化硝基藍(lán)四哇可生成藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)體系中加入抗氧化劑時(shí)，與NBT反應(yīng)生成的藍(lán)色物質(zhì)的量減少，因此通過(guò)反應(yīng)體系的吸光度

14、值的變化可測(cè)定此化合物的抗氧化活性。旱蓮草總黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。由圖1可知，隨著濃度的增加，清除作用也隨著增大，旱蓮草對(duì)O-2產(chǎn)生50%清除效應(yīng)所需的樣品濃度為IC50= 0.08 mgml-1（已換算為總黃酮的質(zhì)量濃度），當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.18 mgml-1時(shí)，清除率達(dá)到87.7 %。相同條件下測(cè)得蘆丁的IC50 =0.05 mgml-1，表明旱蓮草總黃酮和蘆丁對(duì)超氧自由基的清除作用比較接近。圖1 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用（略）3.3 對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH的清除作用旱蓮草總黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH的清除作用見(jiàn)圖2。由圖2可知，旱蓮草總

15、黃酮對(duì)OH的IC50 = 0.015 mgml-1，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.09 mgml-1時(shí)，清除率達(dá)到84.1 %。相同條件下測(cè)得蘆丁的IC50 =0.003 mgml-1，說(shuō)明旱蓮草總黃酮對(duì)OH表現(xiàn)出很好的清除作用。 圖2 對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生OH的清除作用（略）3.4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用硫代巴比妥酸（TBA）可與丙二醛（MDA）類(lèi)似物反應(yīng)生成粉紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在532 nm處有最大光吸收，采用TBA反應(yīng)可定量檢測(cè)卵磷脂被氧化損傷時(shí)產(chǎn)生MDA的量，加入抗氧化物質(zhì)可間接測(cè)出卵磷脂被氧化損傷的抑制率。旱蓮草總黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用見(jiàn)圖3。由圖3可知，旱蓮草總黃酮對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制

16、率為IC50 = 0.02 mgml-1，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.12 mgml-1時(shí)，抑制率達(dá)到73.4%，隨后，抑制率趨于平穩(wěn)。圖3 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用（略）3.5 對(duì)OH引發(fā)DNA損傷的抑制作用采用TBA反應(yīng)可定量檢測(cè)脫氧核糖或DNA上脫氧核糖環(huán)的受OH攻擊氧化斷裂產(chǎn)生的丙二醛類(lèi)似物12。旱蓮草總黃酮對(duì)OH引發(fā)DNA損傷的抑制作用見(jiàn)圖4。由圖4可知，加入樣品后，DNA氧化損傷被抑制，抑制率隨著濃度的增加而增大，旱蓮草總黃酮對(duì)OH引發(fā)DNA損傷的半抑制率為IC50=2.0 gml-1，當(dāng)質(zhì)量濃度為3 gml-1時(shí)抑制率達(dá)到87.8 %。相同條件下測(cè)得蘆丁的IC50=0.1 mgml-1，

17、說(shuō)明旱蓮草總黃酮對(duì)OH引發(fā)DNA損傷的抑制作用優(yōu)于蘆丁。圖4 對(duì)OH引發(fā)DNA損傷的抑制作用（略）4 討論 旱蓮草含有芹菜素( apigenin) 、木樨草素(luteolin) 、槲皮素(quercetin) 以及芹菜素-7-氧-葡萄糖苷( apigenin-7-O-glucoside) 和木樨草素-7-氧-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside) 等黃酮類(lèi)化合物13。研究表明，含酚羥基的化合物具有明顯的清除氧自由基的作用，這種清除氧自由基的能力來(lái)自于酚羥基的供氫或供 電子 能力14。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)旱蓮草中黃酮類(lèi)物質(zhì)有很好的清除氧自由基作用，并且能有效抑制MDA生成，具有很好

18、的抗脂質(zhì)過(guò)氧化及保護(hù)DNA免受自由基氧化損傷的能力，為旱蓮草的藥理研究提供一些理論上的依據(jù)?！?參考文獻(xiàn) 】 1 林朝朋，芮漢明，許曉春. 墨旱蓮總黃酮提取工藝的研究J. 中國(guó) 食品添加劑，2005，1:25.2 湯海峰，趙越平，蔣永培，等.中藥墨旱蓮的研究概況J.西北藥物雜志,1999，14(1):32.3 吳仁亮.旱蓮草亦蔬亦藥J.烹調(diào)知識(shí),1999，4：43.4 凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康M.北京：化學(xué) 工業(yè) 出版社,2004.5 張 梅，邱曉輝，劉 梅. 旱蓮草中黃酮類(lèi)成分的免疫調(diào)節(jié)作用J.中草藥，1997，28(10):615.6 王自軍，薛 梅，邊 麗.旱蓮草中總黃酮和鞣質(zhì)的超聲提取與含量測(cè)定J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16(8):759.7 劉杰超，王思新，焦中高，等.蘋(píng)果多酚提取物抗氧化活性的體外試驗(yàn)J.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005，22(2):106.8 靳學(xué)遠(yuǎn)，唐艷紅，秦 霞，等. 蘋(píng)果渣多酚抗氧化性質(zhì)的研究J.廣西輕工業(yè)，2007，1(1):3.9 呂曉玲，朱惠麗，姜平平，等.紫蘇提取物抗氧化活性體外實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)食品添加劑，2003，5:22.10 劉 金，張立偉.連翹酯苷對(duì)OH引發(fā)的DNA 損傷的防護(hù)作用J.實(shí)驗(yàn)中醫(yī)藥學(xué)，2006，7(1)：23.11 Zou Guo-lin,Zhang Fan,Ou R