柱層析分光光度法測定益母草中總黃酮含量

1、柱層析分光光度法測定益母草中總黃酮含量        【摘要】     目的建立益母草藥材總黃酮含量測定方法，并對藥材資源進行初步考察。方法以蘆丁為對照品，樣品經(jīng)聚酰胺柱分離純化，三氯化鋁試劑顯色后，采用紫外分光光度法在412 nm波長處測定總黃酮含量。結(jié)果蘆丁在4.829.0 g/ml范圍內(nèi)與吸光度有良好線性關(guān)系，r=0.999 6，平均回收率為102%，RSD=3%。結(jié)論該方法操作簡單、準確，可作為益母草藥材的質(zhì)量分析方法。    

2、 【關(guān)鍵詞】  益母草； 總黃酮； 柱層析分光光度法    Quantitative Determination of Total Flavonoids in Herba Leonuri by Column ChromatogramUV SpectrophotometryYU Danni, XU Desheng, FENG Yi， WEI HongchangShanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,ChinaAbstract：Objectiv

3、eTo establish the method for the quantitative determination of total flavonoids in Herba Leonuri, make the prime examination of the resources.MethodsThe sample was treated with a polyamide column for separation and purification ,and was colorated with aluminium trichloride ,and then,the content of f

4、lavone in the sample was determined at the wavelength of 412 nm by ultraviolet spectrophotometer with rutin as control.ResultsIt showed a good linear relationship in the range of 4.829.0 g/ml，r=0.9996 the average recovery of the added sample was 102% and RSD was 3% .ConclusionThe method is simple an

5、d accurate. It can be used for the quality control.Key words：Herba Leonuri;  Total flavonoids;  Column chromatogram UV spectrophotometry    益母草為唇形科益母草屬植物Leonurous heterophyllus Sweet的干燥地上部分，性味苦、辛、微寒，歸肝、心包經(jīng)，具有活血化淤、利尿消腫的功效1。主要含生物堿、二萜、環(huán)烯醚萜苷、黃酮、有機酸等成分2。中國藥典以生物堿作為益母草藥材的含量測定指標。近幾年

6、來，黃酮成分開始受到專家和學者的關(guān)注。益母草中含有多種黃酮，如蘆丁、槲皮素、山柰素及苷，洋芹素、芫花素及苷等3，研究表明益母草黃酮在心血管方面藥理作用顯著4。益母草藥材和制劑中總黃酮含量測定報道不多，絕大部分是藥材經(jīng)初步提取后直接測定，首次將柱層析引入益母草藥材和制劑的含量分析5。目前，益母草總黃酮含量測定仍存在較大不足，如提取、除雜方式選擇混亂導(dǎo)致測定干擾成分較多、顯色方法選擇缺乏依據(jù)等等，同時未見益母草藥材中總黃酮資源的報道。本實驗通過薄層色譜模擬柱層析條件，確定了藥材的除雜方式，對益母草藥材總黃酮含量測定方法進行了系統(tǒng)考察，并測定了6個地區(qū)益母草藥材的總黃酮含量。1  儀器與試

7、藥    Aglient8453紫外可見分光分析儀，752-N型分光光度計（上海分析儀器廠），BP211D sartorius電子天平。    益母草（6個產(chǎn)地藥材分別購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?、齊齊哈爾市百合中藥飲片加工有限責任公司、河南光山縣藥材公司、廣州市健和中藥飲片有限公司、安徽亳州藥材市場、廣東市藥材市場，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學生藥教研室周秀佳老師鑒定均為唇形科植物益母草Leonurus heterophyllus Sweet）。    蘆丁、槲皮素、山柰素對照品（均購自上海標準化中心）；聚酰胺薄膜

8、、柱層析用聚酰胺80100目（浙江臺州市路橋四青生化材料廠產(chǎn)品）；甲醇、無水乙醇、氯化鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  顯色方法的選擇亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉和三氯化鋁為總黃酮測定中最常用的顯色劑6，7。前者顯色后測定波長為510 nm左右，后者在410 nm或270 nm附近。因益母草藥材在500 nm處有較多的干擾吸收，且樣品溶液中存在的槲皮素、山柰素等黃酮成分，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后在500 nm處吸收較弱或無吸收8，因此，采用亞硝酸鈉硝酸鋁氫氧化鈉做顯色劑并不理想。所以選擇三氯化鋁為顯色劑，蘆丁為對照品，進行總黃酮含量測

9、定。2.2  除雜條件的確定取益母草藥材適量，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取至提取液無色，三氯甲烷液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解為供試品溶液A。藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無色，提取液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解為供試品溶液B。將以上樣品及相應(yīng)對照品溶液分別點樣于聚酰胺薄膜上，先以水展開，水展開后將薄膜取出晾干，再以不同濃度乙醇展開，展開后的聚酰胺薄膜噴以三氯化鋁試液，于365 nm紫外燈下觀察熒光。薄層色譜圖見圖13。    薄層預(yù)示說明，聚酰胺吸附可去除葉綠素（供試液A部分）。水洗脫和20%乙醇洗脫可去除具有顯色干擾的水溶性成分。70%

10、乙醇洗脫可富集總黃酮。2.3  藥材總黃酮提取方法的比較分別取藥材細粉3 g，加入甲醇50 ml，以回流（45 min），索氏提?。ㄖ翢o色），超聲（200 w,59 kHz，45 min）3種方法進行提取，測定吸光度，計算總黃酮得率。結(jié)果提取方式選擇回流提取。2.4  益母草藥材中總黃酮的測定    結(jié)果表明，蘆丁對照品及樣品在273 nm處均有最大吸收峰，在412 nm處，蘆丁有最大吸收，樣品吸收強卻不顯示為最大吸收峰。實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)聚酰胺除雜后273 nm處干擾仍然顯著。因此選擇412 nm為測定波長。   

11、結(jié)果表明，黑龍江產(chǎn)益母草總黃酮含量最高，為3.27 mg/g；廣西產(chǎn)益母草總黃酮含量最低，為0.7 mg/g。提示益母草中有效部位含量與地域、種屬、采摘季節(jié)等因素有著密切的聯(lián)系。3  討論3.1  聚酰胺薄層預(yù)試與藥材聚酰胺柱分離結(jié)果吻合，實驗通過薄層考察了10%，20%，30%乙醇除雜效果，以20%乙醇為最好，洗脫選用60%，70%，80%乙醇進行比較，70%洗脫雜質(zhì)少，且洗脫劑用量較小，因此，確定以70%乙醇洗脫總黃酮，洗脫用水和乙醇用量均以洗脫液薄層分析確定。3.2  關(guān)于藥材和提取物中總黃酮的含量測定國內(nèi)報道一直較為混亂，各藥材所含黃酮種類不一，在對照品、

12、除雜方式、檢測方法等方面應(yīng)有所選擇9，10，本實驗以聚酰胺精制，除去大量干擾物質(zhì)，使測定結(jié)果更趨合理，此方法可用于益母草藥材及總提取物的含量測定。3.3  實驗中曾對不同的含量測定方法進行比較，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色比以三氯化鋁顯色測定結(jié)果偏高。不同的除雜方式對測定結(jié)果也有影響，與氯仿除雜相比，經(jīng)聚酰胺柱除雜后測得的結(jié)果較低。因此，除雜方法和含量測定方法的選擇在分光光度法測定總黃酮含量的過程中至關(guān)重要。    【參考文獻】  1國家藥典委員會.中國藥典S.北京：化學工業(yè)出版社，2005：V011.2Zhang Xian,Pe

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15、ianxhixue GranuleJ.J Nanjing University of traditional medicine and for Nat Sci.2005，16（5）：398.7Huang Suo-yi，Li hai-ni，YuMei-liao et Extraction and Distin2uishin2of the Total Flavone from LeonurusJ.Lishizhen Medicine And Materia Medica Research（時珍國醫(yī)國藥）,2005，15（5）：398.8Guo Y J，F(xiàn)an L，Wang XQ,et al.Discussion about NaNO2AL(NO3)3NaOH colorimetry for determination of total flavonoidsJ.Chin J Pharm Anal（藥物分析雜志），2002，22（2）：97.9Liu Xiaorou ,Wang Gun-fang ,YanQi-xin Quantitative determination of Flavonoids in GBE in health foodJ.Sinece and Technology of Food Industry（食品工業(yè)