蛋白質(zhì)抗原的表位分析

1、有鑒定表位的相關(guān)技術(shù)和文獻。也有一些表位預(yù)測軟件。 一般來說，目前研究主要集中在線性表位上，而構(gòu)象表位的預(yù)測和鑒定方法目前不 是很成熟。找到一個帖子，樓主可以參考：1、B 細胞表位預(yù)測對于多種免疫學(xué)研究是必不可少的。針對不同的蛋白，應(yīng)選擇不 同的方法。一般來說，蛋白質(zhì)的 C 端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以 是很好的抗原決定簇區(qū)域。本課題選用的蛋白質(zhì)C-末端序列標簽都是唯一的、或是其家族中的幾個成員所共有的。在人蛋白質(zhì)中，約81%的蛋白質(zhì)其C末端的5個氨基酸殘基的小肽是該蛋白質(zhì)所特有的，制備針對蛋白質(zhì)C末端小肽的抗體，常常能得到特異性識別該全蛋白的抗體。另外，蛋白的二級結(jié)構(gòu)是 B 細

2、胞表位計算機預(yù)測 的重要參數(shù)之一，B轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié) 合，較可能成為抗原表位。而 a螺旋和B折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體， 一般不作為抗原表位。 含有 5 個以上的氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角又常稱為環(huán) （loop） 。以往的 研究表明， 蛋白表面的 loop 區(qū)可能為功能性抗體的識別位點， 特異性好， 可及性強。 本課題選用的 HPO、 G-CSF、 HSA 空間結(jié)構(gòu)已明確，所以直接選擇 loop 區(qū)或無規(guī) 卷曲作為 B 細胞表位。舉例：人Pif1基因編碼至少兩種蛋白亞型，分子量分別為74kDa和80kDa,與酵母具有高度的同源性，a型和B型Pif1只有C末端

3、不同20，其余部分完全相同，并且二者 的C末端在蛋白數(shù)據(jù)庫中都是唯一的，選擇a型和B型的C末端作為B細胞表位，既滿足特異性的需要，也能區(qū)分亞型。GPAA1 是一種跨膜蛋白，原核表達非常困難，形成包涵體，且包涵體難以溶解和復(fù) 性。對這一類型的蛋白，非常適合選擇其特有的 B 細胞表位免疫動物，來最終制備 識別全蛋白質(zhì)的抗體。 ABCpred 是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的線性 B 細胞表位預(yù)測工 具，該系統(tǒng)檢驗了源于 Bcipep數(shù)據(jù)庫的700個非冗余B細胞表位和源于Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫的 700 個長度為 1020 個氨基酸的隨機選擇多肽，準確率近 66%。 Bepipred 結(jié)合隱馬爾科夫模

4、型和親水性參數(shù)評分預(yù)測線性 B 細胞表位， AROC 評分達到 0.671。將兩種預(yù)測方法得到的預(yù)測結(jié)果進行比較， 其共有的預(yù)測表位是真正 B 細胞 表位的幾率更大，如果能進一步結(jié)合蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，就可以選出可信度 更高的 B 細胞表位。 如何選擇有效的 B 細胞表位是能否實現(xiàn)無完整蛋白質(zhì)抗原條件 下抗體制備的關(guān)鍵。2、對于 B 細胞表位的選擇，對于已有空間結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原，直接選擇蛋白 分子表面的 loop 區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列作為候選 B 細胞表位；對于缺乏空間 結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原，需要根據(jù)蛋白質(zhì)抗原的特點具體分析。若蛋白質(zhì)抗原C末端的序列親水性好，可以選擇C末端的61

5、0個氨基酸的序列作為候選 B細胞表位， 并且最好該序列為該蛋白質(zhì)所特有；也可采用 B 細胞表位預(yù)測程序進行分析，選擇 不同程序預(yù)測的共有 B 細胞表位；對于同源性很高的家族蛋白，根據(jù)序列比對結(jié)果 選擇差異較大的區(qū)域，并且所選序列應(yīng)該符合 B 細胞表位的特征?；谝陨显瓌t， 本實驗選擇了 10個蛋白的 14 個表位，并對其中的 12 個表位進行了驗證。3、對于 B 細胞表位的選擇，（1） 對于空間結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)，直接選擇蛋白分子表面的loop 區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū) 域的小肽序列。（2）對于空間結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)，可采用以下策略進行選擇：A :若蛋白質(zhì)C末端序列的親水性好，可以選擇 C末端的610氨基酸

6、的序列作為 候選 B 細胞表位，最好該序列為該蛋白質(zhì)所特有。 可采用 SIB BLASTNetwork Service(http:/www.expasy.ch/tools/blast/)的 BLAST 軟件進行比對，數(shù)據(jù)庫選擇homosapiens；B:采用B細胞表位預(yù)測程序 ABCpred和BepiPred等進行表位預(yù)測，選擇不同程序 預(yù)測的共有 B 細胞表位；C:對于同源性很高的蛋白質(zhì)，首先根據(jù)序列比對結(jié)果選擇差異較大的區(qū)段，并且 所選序列應(yīng)該符合 B 細胞表位的特征。4、 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別應(yīng)用 EX-PASY 服務(wù)器(http: /www. expasy. org/tools)上的 G

7、OR44>、 HNN (Hierarchical Neural Network meth-od) 、 SOPMA、 nnPredictUniversity ofCalifornia atSa nFran cisco (UCSF)> 等方法。親水性、柔韌性、表面可能性和抗原表位預(yù)測應(yīng)用 DNAstar 軟件的子程序Protean采用Hopp-Woods禾口 Kyte-Doolittle方案預(yù)測氨基酸的親水性 5, 6>,采用 Karplus-Schultz和Emini方案預(yù)測柔韌性及表面可能性7, 8>,采用Jameson-Wolf方案 9>和吳氏抗原指數(shù)法 10&

8、gt;預(yù)測潛在的 B 細胞抗原表位。5、對獲取序列的生物信息學(xué)處理分析使用 DNASTAR 軟件分析獲取的序列 ,結(jié)合 NCBI 上的 BLAST 尋找最匹配的短 序列。用全部和部分肽序列查詢各國專利數(shù)據(jù)庫 :http: /appft1. uspto. gov/netahtml/PTO/search-adv. ht/http: /www. freepatentsonline. com /5194592. htm /http: /www. stcsm. gov. cn/resource/data/zhuanl.i asp#1使用蛋白質(zhì)在線分析工具分析多肽的疏水性、PI值、穩(wěn)定性:http: /w

9、ww. expasy. org/http: /www. rcsb. org/pdb/cgi/explore. cg?i pdbId=1fi6http: /www. rcsb. org/pdb/search/searchSequence. dohttp: /www. expasy. org/sitemap. htmlhttp: /www. expasy. org/tools/#translatehttp: /www. expasy. org/tools/blast/常用數(shù)據(jù)庫和預(yù)測工具：名稱 網(wǎng)址 說明ABCpred http:/www.imtech.res.in/raghava/abcpred

10、 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)線性 B 細胞表位預(yù) 測工具AgAbDb http:/202.4 1.70.51:8080/agabdb2/ 抗原-抗體共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分子相互作用數(shù) 據(jù)庫AntiJen http:/www.jenner.ac.uk/AntiJen B 細胞表位定量結(jié)合數(shù)據(jù)庫Bcipep http:/www.imtech.res.in/raghava/bcipep/ B 細胞表位數(shù)據(jù)庫Bepipred http:/www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred 基于序列的線性表位預(yù)測工具 CEP http:/bioinfo.ernet.in/cep.htm 基于結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和非連續(xù)

11、性表位預(yù)測工具 DiscoTope http:/www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope 基于序列 /結(jié)構(gòu)的非連續(xù)性表位 預(yù)測工具Epitome /services/epitome 抗原-抗體相互作用殘基數(shù)據(jù)庫 HIV database /content/immunology HIV 免疫表位數(shù)據(jù)庫IEDB T 細胞和 B 細胞表位數(shù)據(jù)庫含陰性數(shù)據(jù)IEDB B-cell /t

12、ools/bcell/iedb_input 基于序列的線性表 位預(yù)測工具epitope tools 6、B 細胞表位預(yù)測的方法及應(yīng)用 線性表位的預(yù)測方法B 細胞表位的預(yù)測方法主要集中于線性表位，在二十世紀七、八十年代發(fā)展起來的 大量的預(yù)測B細胞表位的算法都是基于蛋白質(zhì)序列。這些算法包括：蛋白質(zhì)的親 水性算法 (Hydrophilicity) ：認為蛋白質(zhì)各氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基兩 類。在機體內(nèi)，疏水性殘基一般被埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于蛋白質(zhì)表面， 因此，蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有著密切的聯(lián)系。 Hopp-Woods(Hoop TP et al.,1981)算法為最常用的。

13、可及性算法(Accessibility):常用的有Janin可及性參數(shù)， 即指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性(Rudolph R et al.,1990)。它反映了蛋白質(zhì)抗原各個氨基酸殘基的分布情況。蛋白質(zhì)可塑性算法(Flexibility):此算法認為蛋白質(zhì)抗原構(gòu)象的多肽鏈骨架具有一定程度的活動性，活動性強的氨基酸 殘基即可塑性大，易形成抗原表位(Karplus PA et al.,1985)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 算法(Secondary structure)：該算法認為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)表位的分布關(guān)系密 切。a螺旋、B折疊化學(xué)鍵鍵能比較高，形態(tài)固定，常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，難以

14、與抗體 嵌合，而B轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多處于蛋白質(zhì)的表面，結(jié)構(gòu)松散，易展示在蛋白質(zhì)表 面，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性大(來魯華,1993)。 蛋白質(zhì)抗原性算法(Antigenicity) : Welling(Welling GW.,1985)通過對20個已研究得很透的蛋白質(zhì)的 69 個連續(xù)位點的 606個氨基酸統(tǒng)計分析， 用各氨基酸殘基在已知 B 細胞表位中出現(xiàn) 的百分率與其通常在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的百分率比值的對數(shù)建立了抗原性刻度，并以此 計算蛋白中各亞序列的抗原性。 這些方法的代表軟件有 PEOPLE(Alix AJ et al.,1999)、 PREDITOP(Pellequer JL

15、 et al.,1993)、 BEPITOPE(Odorico M et al.,2003)、 Bcepred(Saha S et al.,2004)等。但是最近 Blythe 及 Flower(Blythe MJ et al.,2005)對氨基酸的性質(zhì)與 線性表位的關(guān)系做了一個評估，結(jié)果表明基于氨基酸序列信息來預(yù)測線性表位，即 使很好的結(jié)合了氨基酸的各種性質(zhì)，其預(yù)測結(jié)果僅略強于隨機預(yù)測。近年來，一些 應(yīng)用隱形馬爾可夫模型(HMM)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)、支持向量機算法(SVM)及其 他技術(shù)的機器研究方法(Po no mare nko JV et al.,2007)已經(jīng)被引入來預(yù)測 B細胞表

16、位， 取得了較好的結(jié)果。代表軟件有 ABCpred(Saha S et al.,2006)、 BepiPred(Larsen JEet al.,2006)、APP(Chen J et al.,2007等。ABCpred采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測線性表位， 從Bcipep和SwissProt數(shù)據(jù)庫中提取非冗余的表位肽和非表位肽作為訓(xùn)練集，采用 5-折交叉驗證，預(yù)測敏感性約為 67%，特異性約為 64%。 BepiPred 結(jié)合氨基酸的性 質(zhì)(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角)和隱形馬爾可夫模型來預(yù) 測線性表位， 預(yù)測結(jié)果表明， 同那些僅依賴于氨基酸性質(zhì)的預(yù)測方法相比， BepiPred

17、預(yù)測結(jié)果的準確性有一定程度的提高。Chen et al.(2007)發(fā)現(xiàn)氨基酸通常成對出現(xiàn)在抗原表位的頻率要比其出現(xiàn)在非表位肽段的頻率高，基于此，并聯(lián)合支持向量機算 法建立了 APP方法。應(yīng)用此方法在872個表位肽和872個非表位肽數(shù)據(jù)集中，采用 5-折交叉驗證，預(yù)測準確度為 71%。 Yasser EL-Manzalawy(EL-Manzalawy Y et al.,2008) 等采用同一數(shù)據(jù)集對這三種方法進行比較， 結(jié)果表明 ABCpred 預(yù)測表位的準確性略 高于 BepiPred 及 APP。構(gòu)象表位的預(yù)測方法目前，絕大多數(shù) B 細胞表位預(yù)測方法都是基于蛋白質(zhì)的一級或二級結(jié)構(gòu)的，但這些

18、方法只能用來預(yù)測由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位，而基 于蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)來預(yù)測構(gòu)象表位的方法比較少，這是因為各種抗原的構(gòu)象表位 可獲得的數(shù)據(jù)要遠遠少于線性表位，并且到目前為止，幾乎沒有哪個抗原的所有的 表位都能夠徹底的研究清楚(HasteAndersen P et al.,2006基于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)來預(yù) 測 構(gòu)象 表 位 的 方法 CEP(Kulkarni-Kale U et al.,2005)(Conformational Epitope Prediction)：這是第一個以抗原蛋白的三級結(jié)構(gòu)PDB文件作為輸入條件，以構(gòu)象性表位預(yù)測為主要目的的網(wǎng)上免費服務(wù)軟件。它提供了一個預(yù)測構(gòu)象表位的

19、web界面，這種方法除了能夠預(yù)測構(gòu)象表位，同時也能預(yù)測線性表位。它主要根據(jù)氨基酸殘基 的 溶劑可及性及空間距離截值來預(yù)測 表位 ， 其公布的 預(yù)測 精度達 75%。 DiscoTope(Haste An dersen P et al.,2006:)是通過蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來預(yù)測構(gòu)象表位 的一種新方法，這種方法通過對 X 射線晶體衍射確定的 76 個抗原抗體復(fù)合物所組 成的構(gòu)象表位數(shù)據(jù)集進行大量統(tǒng)計度量、空間特征分析和表面可及性計算，對 B 細 胞構(gòu)象性表位進行預(yù)測，最終對組成蛋白序列的每個氨基酸打分，通過分值來反映 某一氨基酸成為表位的可能性，并提供了閾值來確定組成表位的氨基酸殘基。預(yù)測 蛋白

20、質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用位點的方法除以上兩種方法之外，還有最近發(fā)展起來的一 些預(yù)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用位點的方法。 由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種，因此， 可以參這些方法來預(yù)測 B 細胞表位。分子對接：主要用來研究分子間的相互作用與 識別，進而預(yù)測復(fù)合物結(jié)構(gòu)。常用的分子對接軟件有 ZDOCK(Chen R et al.,2003) 、 DOT(Shoichet BK et al.,1991)、DOCK(Mandell JG et al.,2001)、ClusPro(Comeau SR et al.,2004)等。其中ClusPro是一個提供網(wǎng)上服務(wù)的分子對接軟件，

21、其能夠根據(jù)形狀互 補快速的篩選 ZDOCK 和 DOT 程序產(chǎn)生的對接結(jié)果， 并對對接結(jié)果聚類， 根據(jù)聚類 情況對對接結(jié)果打分， 最終返回 10 個得分最高的對接結(jié)果， 再根據(jù)這些對接結(jié)果來 確定蛋 白 質(zhì)相互作用的 位點。 PPI-Pred(Bradford JR et al.,2005)(protein-protein in terface predicti on)將支持向量機的方法同曲面分析結(jié)合在一起預(yù)測蛋白質(zhì)相互作 用 位 點 。 ProMate(Neuvirth H et al.,2004)(Predicting the location of potential prote in-prote in binding sitesfor unbound prote ins)是將一些蛋白質(zhì)相互作用界面的重要 性質(zhì)綜合起來預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用位點。這些性質(zhì)包括：結(jié)合位點通常偏向位于B片層及非結(jié)構(gòu)的鏈；芳香族氨基酸的側(cè)鏈常會參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用；疏 水氨基酸和極性氨基酸常聚集在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的界面；以及在晶體結(jié)構(gòu) 中結(jié)合位點的周圍有更多的水分子與之結(jié)合。Ponomarenko和Bourne采用以上幾種方法預(yù)測構(gòu)象表位并使用同一評估體系對其進