液相色譜柱的故障診斷與維護(hù)

1、液相色譜柱的故障診斷與維護(hù)（二）液相色譜柱的故障診斷與維護(hù)（二）寬 峰* 在進(jìn)樣口到柱或柱到檢測(cè)器之間，使用細(xì)的短的連接管 * 保證所有的管路接頭都使用正確 * 用小體積檢測(cè)池 * 減少進(jìn)樣量 Extra column dispersion looks like this.On one system with one column, the peaks are nice and sharp. On a different system or with a different column or chemist, the analysis looks like the one on the ri

2、ght. Tubing is the number one cause of this band broadening from dispersion. Make sure you are using short, small id tubing between the injector and column and between column and detector, eliminating as much additional dead volume as possible. If using a different system in a different lab, do not

3、be fooled by the length of the tubing alone. Check the ID! Make sure all connections are made with matched fittings, as we will see later. This includes unions, column end fittings, and injector/detector fittings. Check to volume of the detector flowcell to make sure it is compatible with the column

4、. Smaller id columns require smaller flowcell volumes if you would like to maintain the efficiency of the separation. Make sure your injection volumes have not increased due to a software programming error in the method. Check the microliters injected. Also check the sample concentration to make sur

5、e it is not 10 or 100 times more concentrated than you think, the attenuation will give this one away.柱外體積效應(yīng)的影響壓力I. 不進(jìn)樣時(shí)柱壓連續(xù)升高- 泵密封墊- 流動(dòng)相有顆粒- 流動(dòng)相溶解性- 流動(dòng)相的不穩(wěn)定性 (聚合)- 形成柱死體積 (與使用條件有關(guān))II. 進(jìn)樣時(shí)壓力升高- 樣品有顆粒- 樣品在流動(dòng)相中不溶- 樣品組分與固定相不兼容保留值漂移I. 所有峰都向低保留值方向漂移（酸、堿、中性化合物）- 鍵合相流失- 流動(dòng)相不穩(wěn)定 (可能性較小)- 溶劑輸送系統(tǒng) (流速變化)II. 所有峰

6、都向高保留值方向漂移- 在水/有機(jī)溶劑的混合體系中，有機(jī)溶劑含量減少- 柱改變 (可能性較小)- 溶劑輸送系統(tǒng) (流速變化)III. 離子型化合物的色譜峰的保留值漂移-流動(dòng)相中揮發(fā)性組分損失 (離子強(qiáng)度, pH 漂移)- 柱改變 (鍵合相或污染)保留值漂移 I. 與流動(dòng)相有關(guān)的問(wèn)題- 使用新鮮的流動(dòng)相   ?pH   ?電導(dǎo)   ?色譜性能測(cè)試II. 與色譜柱有關(guān)的問(wèn)題- 測(cè)試新柱- 用標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試混合樣測(cè)試新柱- “清洗” 色譜柱后再測(cè)- 考慮樣品基質(zhì)與使用條件對(duì)柱穩(wěn)定性的影響良好的柱使用規(guī)范  在使用前過(guò)濾溶劑

7、完全潤(rùn)濕在運(yùn)輸中變干的色譜柱 了解溶劑對(duì)樣品的溶解性及分離的影響 對(duì)含有保留性較強(qiáng)的雜質(zhì)組分的樣品要進(jìn)行預(yù)處理 清除柱填料的局限性    pH    溫度    化學(xué)兼容性 使用新鮮的水溶液，并考慮使用生物穩(wěn)定劑（如疊氮化鈉） 定期用強(qiáng)極性的溶劑清洗色譜柱 l儲(chǔ)存色譜柱時(shí)，應(yīng)沖凈緩沖言，并用有機(jī)溶劑飽和色譜柱（乙腈） l避免外力損傷色譜柱：彎曲、跌落或?qū)⒔宇^擰的過(guò)緊 Now lets cover some good column practices that will help you to increase your column

8、lifetime. Filter solvents before you use them. The column is the HPLC systems best filter, so make sure the column isnt performing this task. Pretreat samples that contain strongly retained compounds of no interest. This means to remove any sample matrix, or contaminants, or incompatible analytes to

9、 the method/column. Solid phase extraction is good for this clean up. Avoid extreme column temperatures, greater than 60 degrees, or check the vendor limits. Some columns are now made for higher temperatures. Flush/clean the column often with strong solvents. Also use gradient cleaning. Keep the mob

10、ile phase pH between 3 and 7 unless otherwise indicated by the column vendor (polymeric phases). If it is necessary to do this, use a precolumn and expect a shorter lifetime. Always use fresh buffer solutions and aqueous mobile phases or treat them with sodium azide, this can be dangerous. Water sol

11、utions grow "bugs" or bacteria, these will contaminate and permanently modify the stationary phase. In line with the last point, prepare columns for storage by rinsing all of the buffer out of the column, then store in the appropriate solvent, at least 50% organic. This will keep bacteria

12、from growing on the column. Make sure to rinse the buffer off first and with water, as many buffer salts precipitate in 100% organic. Then cap the column tightly to keep air out. Avoid physically mishandling the columns. This includes banging, dropping, overtightening fittings, and hitting your lab

13、partner預(yù)柱與保護(hù)柱Here is a schematic illustrating the difference between a pre-column and a guard column. A pre-column is an in-line filter device for filtering solvents prior to the injection valve where the sample is introduced. A guard column protects the analytical column from sample contaminants th

14、at are strongly or permanently retained by the column phase. 帶可重復(fù)使用接頭及完整保護(hù)柱的卡套柱A more recent cartridge column design that we use at Hewlett-Packard is shown here.This design helps to incorporate in-line sample filtration and clean up devices, like filters and guard columns. A guard cartridge can be

15、easily inserted into the column holders by reversing the collets at the front end. This requires no additional hardware and adds no additional delay volume with respect to the more traditional approach of two columns and tubing. This design also allows for truly resusable end fittings. Since the sam

16、e column holder will fit any size HP-cartridge column of any of the offered phases, there is no need to remake the end fittings to accommodate a different column. The guards can help to automate some sample prep, and are inexpensive compared to traditional guard columns. 帶Techtron保護(hù)柱的Zorbax 卡套柱制備樣品:

17、 流動(dòng)相When manually preparing the sample, make sure to filter and remove particulates. Use a filter that is compatible with the sample solution. There are aqueous and organic filters. Dissolve the sample in the mobile phase if you can. If not, use a solvent that is different but weaker with respect to

18、 the mobile phase strength in the mode of HPLC you are using. Sometimes when the sample is dissolved in a different solvent, peak doubling can occur. Keep the sample volume as small as possible. Sometimes when a sample is partially soluble, it is attractive to add more mobile phase to dissolve the s

19、ample and the inject more volume for the same amount of sample mass on column. This only works to a point, then the bands become too broad and resolution is lost.在安裝柱前后測(cè)試壓力差如果柱壓力太高，反裝色譜柱，并用10-20倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱，監(jiān)測(cè)壓力變化若出現(xiàn)沉淀 (如：蛋白凝聚、細(xì)胞物、聚合物) 設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如 0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 鹽酸胍, THF, HFIP若仍無(wú)效，應(yīng)考慮更換過(guò)濾片

20、色譜柱故障診斷與排除更換柱頭過(guò)濾片色譜柱修復(fù)和再生化學(xué)變化由于鍵合相的水解或硅膠的溶解而造成的色譜柱填料的變化是不可逆的由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過(guò)適當(dāng)?shù)那逑词怪迯?fù)梯度洗脫的方式 (水 -> 強(qiáng)有機(jī)溶劑) 通常最有效低 pH 流動(dòng)相, 如 0.1% TFA or 0.01M H3PO4, 也是有效的升高溫度（60-80）Example: 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate: 1 mL / min; Temp: 80 A: 0.1% TFA in water B: 0.1% TFA in acetonitrile 100% A

21、for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min. Repeat 3 times. l6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積 lXDB, 有機(jī)聚合物等填料可使用高pH 水溶液 /有機(jī)溶液，如： 0.01M NaOH 50% 異丙醇 /水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時(shí)間 (15-30 min). 總   結(jié) 如果使用時(shí)加以注意，大部分的液相色譜柱的問(wèn)題是可以預(yù)防的 - 流動(dòng)相必須是互溶的，無(wú)顆粒 - 使用保護(hù)柱和在線過(guò)濾器，并定期更換

22、- 使用恰當(dāng)?shù)臉悠分苽浞椒?- 使用恰當(dāng)?shù)纳V柱清洗程序 - 不同類(lèi)型的色譜柱，請(qǐng)選擇不同的操作條件    (如： SB: pH 1-6, XDB: pH 3-11) - 保存柱反壓及重要的色譜參數(shù)的記錄 (如： R, N, As, k) - 色譜柱需保存在有機(jī)溶劑中 (乙腈)Agilent 1100 LC維護(hù)保養(yǎng)知識(shí)         1、 色譜柱長(zhǎng)時(shí)間不用，存放時(shí)，柱內(nèi)應(yīng)充滿(mǎn)溶劑，兩端封死（如ACN適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機(jī)相）2、 對(duì)于手動(dòng)進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時(shí)，要用水沖洗進(jìn)樣

23、口，同時(shí)搬動(dòng)進(jìn)樣閥數(shù)次，每次數(shù)毫升。3、流動(dòng)相使用前必須過(guò)濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長(zhǎng)菌）。4、帶seal-wash的 1100，要配制90%水+10%異丙醇，以每分23滴的速度虹吸排出，溶劑不能干涸。5、其它主意事項(xiàng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，或由現(xiàn)場(chǎng)工程師介紹。維護(hù)知識(shí)問(wèn)答1、為什么溶劑和樣品要過(guò)濾?溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過(guò)濾頭的類(lèi)型：30mm內(nèi)

24、徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50µl。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7µl。濾膜類(lèi)型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦 用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二

25、氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。2、為什么HPLC用緩沖鹽時(shí)要加在線Seal-wash選項(xiàng)？HPLC用緩沖鹽時(shí),由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng),容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時(shí),必須使用該在線沖洗選項(xiàng).清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類(lèi)生長(zhǎng)和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。3、為什

26、么Agilent 1100LC的流動(dòng)相管路非常細(xì)?在使用HPLC時(shí),應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對(duì)分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小45個(gè)數(shù)量級(jí)，液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測(cè)器）中，樣品分子的擴(kuò)散和滯留，都會(huì)引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動(dòng)相管路。毛細(xì)管線分類(lèi)：0.17mm內(nèi)徑 -綠色 ;0.12mm內(nèi)徑-紅色。 PEEK 管線：內(nèi)徑 -0.13mm;0.18mm;0.25m

27、m;0.5mm。毛細(xì)管線優(yōu)點(diǎn): 柔韌性好. *Agilent 公司同時(shí)備有1/16in 的粗外徑毛細(xì)管線,適用于不同習(xí)慣的用戶(hù) ,優(yōu)點(diǎn)是剛性好,但柔韌性差一些。 4、流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：

28、效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類(lèi)的生長(zhǎng)會(huì)堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞。A：請(qǐng)嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過(guò)濾。B：請(qǐng)勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應(yīng)用

29、許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉. D:在溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣。E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過(guò)濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。6、Agilent 1100LC泵如何維護(hù)？Agilent 1100LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定、無(wú)脈動(dòng)、流量準(zhǔn)確的流動(dòng)相，及時(shí)合理的維護(hù)非常重要。A：流動(dòng)相使用前請(qǐng)必須脫氣、過(guò)濾。B：使用緩沖鹽時(shí)，要加在線Seal-wash選項(xiàng)。C：關(guān)機(jī)前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機(jī)溶劑沖洗系統(tǒng)1

30、0分鐘（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗D：及時(shí)更換Purge Valve內(nèi)的過(guò)濾芯。（當(dāng)打開(kāi)Purge Valve時(shí)，壓力高于10bar，表明過(guò)濾芯已堵）。E：使用合適的密封圈。7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈，特別是長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)，需更換另一種不同的密封圈，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0200bar；建議在泵的壓力限制中，將最大壓力設(shè)為200bar。8、使用梯度比例發(fā)時(shí)要注意那些事項(xiàng)？當(dāng)鹽溶液與有機(jī)溶劑溶液混合時(shí)，鹽溶液能與有機(jī)溶劑溶液