基因工程-第一章 核酸的制備

1、Chapter 1 Preparation of nucleic acid核酸：遺傳信息的儲存物質脫氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid, DNA核糖核酸：ribonucleic acid, RNA區(qū)別：第一節(jié) 天然DNA的制備（Preparation of DNA）一、DNA的組成與結構（ Composition and Structure of DNA）:A phosphate group linked by a phosphodiester bond to a pentose (a five-carbon sugar molecule)that in turn is l

2、inked to a nitrogen- and carbon-containing ring structure commonly referred to as a “base”.BasePentosePhosphate GroupNucleotide主要堿基的化學結構：結構：DNADNA解鏈溫度（Tm，melting point）DNA分子雜交(Hybridization of DNA strands from different sources)環(huán)狀DNA（Circular DNA）超螺旋DNA（supercoiled DNA ，SC-DNA）；共價閉合環(huán)狀DNA（Covalently

3、closed circular DNA，cccDNA）；開環(huán)DNA（open circle DNA，oc-DNA）；線形DNA（linear DNA，L-DNA）二、天然DNA的提取（Purification of DNA）(一)生物材料的準備（Preparation of Material）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（ Ethanol ）1.2.TE溶液（Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.0， EDTA 1 mmol/L ）1.3.低溫2.大腸桿菌（E. coli）常見抗生素（Antibiotics）的使用：2.1 氨芐青霉素（ampicillin，Ap）：抑制細菌

4、細胞壁肽聚糖的合成，50150 g/mL（水溶液）；2.2 鏈霉素（streptomycin，Sm）：與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質(酶)的合成,使細菌不能正常生長或者代謝而死亡， 2550 g/mL（水溶液）；2.3 四環(huán)素（tetracycline，Tc）：與細菌核蛋白體的30S亞單位結合，干擾核糖體上密碼子與反密碼子的相互作用，從而阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結合， 5 mg/mL（乙醇溶液）；2.4 氯霉素（chloramphenicol，Cm）：與細菌核蛋白體50S亞基結合，抑制肽?；D移酶，從而抑制蛋白質合成， 20 g/mL（乙醇溶液）；2.5 卡那霉素（knamy

5、cin，Km）：與細菌核蛋白體蛋白基結合，并與較小的RNA亞基編譯區(qū)的特定堿基結合，從而抑制蛋白質合成， 2550 g/mL（水溶液）；(二)裂解細胞（Cell lysis）：1.化學方法：1.1 CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethy ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），陽離子去污劑，與核酸形成復合物，在高鹽溶液（ 0.7 mol/L NaCl）中穩(wěn)定，在低鹽溶液（ 0.3 mol/L NaCl ）中沉淀。1.2 SDS裂解法：SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸鈉），陰離子去垢劑，蛋白質變性劑，有效沉淀多糖，與K離子形成絮狀沉

6、淀，廣泛用于質粒（plasmid）DNA的提取，蛋白質的分離純化。2.酶裂解方法：2.2 蛋白酶K（Proteinase K）裂解法：用于水解蛋白質，特別是與DNA結合緊密的組蛋白（Histone），廣泛用于動物組織基因組DNA的提取，通常與SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解細胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于細菌裂解，提取質粒DNA，其原理是破壞細菌細胞壁的肽聚糖支架，通過低滲透壓使細胞脹裂，引起細胞裂解。作用條件溫和，pH 6.07.0，室溫25 。（三）DNA的分離和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（ phenol ）-氯仿（ chloroform ）-異戊醇（iso

7、amyl alcohol ）比例：25:24:1，苯酚：蛋白質變性劑；氯仿：蛋白質變性劑；并使變性的蛋白質從水相層分離；異戊醇：防止產(chǎn)生泡沫。2. 氯化銫密度梯度離心法(CsCl density gradient centrifugation)；3. 固相萃取法(solid phase extraction, SPE)；離心技術在基因工程中的應用（Application of Centrifugation techniques ）（四）DNA的純化（purification）和濃縮（condense）1. DNA的純化：1.1 Rnase處理，去除RNA；1.2 離子交換層析法；1.3 氯化銫

8、密度梯度離心法；1.4 瓊脂糖電泳洗脫法；瓊脂糖電泳（Agarose gel electrophoresis）1.安放好制膠模具（梳子和膠槽）2.瓊脂糖凝膠澆灌并冷凝3.移走梳子，暴露出上樣孔4.瓊脂糖膠放置在電泳緩沖液中5. 上樣，通電流，直至DNA遷移到適當位置6. 在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況DNA電泳完畢后的瓊脂糖凝膠在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況不同凝膠的DNA電泳情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺凝膠凝膠（PAGE）電泳儀（電源和電泳槽）離子交換柱層析純化DNA2. DNA的濃縮：2.1 乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2 正丁醇（ butyl alcoho

9、l ）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）濃縮法；第三節(jié)第三節(jié) 人工合成核酸片段人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成二、核酸的酶法合成PCR反應（反應（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶聚合酶鏈式反應）：鏈式反應）： 模仿細胞內發(fā)生的模仿細胞內發(fā)生的DNA復制過程，在體外復制過程，在體外有酶催化合成特異性有酶催化合成特異性DNA片段。片段。PCR技術簡史技術簡史1971年，年，Khorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆復該過程便可克隆tRNA基因。基因

10、。但由于測序和引物合成的困難，以但由于測序和引物合成的困難，以及及70年代基因工程技術的發(fā)明使年代基因工程技術的發(fā)明使克 隆 基 因 成 為 可 能 ， 所 以 ，克 隆 基 因 成 為 可 能 ， 所 以 ，Khorana的設想被人們遺忘了的設想被人們遺忘了PCR技術簡史技術簡史1985年，美國年，美國PE-Cetus公司的公司的Mullis等人等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理基本原理是在試管中模擬細胞內的是在試管中模擬細胞內的DNA復制復制最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶進行聚合酶進行PCR，由于，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易該酶不耐熱，

11、使這一過程耗時，費力，且易出錯出錯耐熱耐熱DNA聚合酶的應用使得聚合酶的應用使得PCR能高效率的能高效率的進行，隨后進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀自動化熱循環(huán)儀1993年，年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學等因此項技術獲諾貝爾化學獎獎1. PCR的基本原理的基本原理(Mechanism of PCR )類似于類似于DNA的體內復制。的體內復制。其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的次循環(huán)反應，使

12、目的DNA得以幾何級數(shù)倍增。得以幾何級數(shù)倍增。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的的含量可以擴大含量可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。（3 3）PCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR反應標準的標準的PCR反應條件：反應條件： 10X緩沖液（緩沖液（Buffer）10 L4種種dNTP混合物混合物 各各200umol

13、/L引物（引物（Primer） 各各10100pmol模板模板DNA （Template） 0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶 0.5 2.5UMg2+ 1.5mmol/LPCR反應1 12 23 34 45 52222555572729494時間（時間（minmin）溫度溫度（）PCR反應適溫延伸適溫延伸3 3高溫變性高溫變性1 1低溫退火低溫退火2 2重復重復1313步步25302530輪輪目的目的DNADNA片段片段擴增擴增100100萬倍以上萬倍以上DNADNA雙螺旋雙螺旋DNADNA單鏈單鏈與引物復性與引物復性DNADNA變性變性形成形成2 2條單鏈條單鏈子鏈延伸子鏈延伸DNADN

14、A加倍加倍37-60 90-9570-75 PCR 擴增No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X1071 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon PCR反應特點反應特點靈敏度高靈敏度高n皮克皮克(pg=10-12)量級擴增到微克

15、量級擴增到微克(ug=10-6)水平水平n能從能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞萬個細胞中檢出一個靶細胞n病毒檢測的靈敏度可達病毒檢測的靈敏度可達3個個RFU（空斑形成單位空斑形成單位） n細菌檢測的最小檢出率為細菌檢測的最小檢出率為3個細菌個細菌簡便、快速簡便、快速n一次性加好反應液，一次性加好反應液，24 小時完成擴增小時完成擴增n擴增產(chǎn)物一般用電泳分析擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低對標本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提織的粗提DNA（1）Taq DNA聚合酶聚合酶（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶（

16、3）Tth DNA 聚合酶聚合酶（4）C.therm 聚合酶聚合酶4.2.1 耐熱性耐熱性DNA聚合酶聚合酶（1）Taq DNA聚合酶聚合酶1986年從一種年從一種75熱泉中的細菌熱泉中的細菌 (Thermus aquaricus)中分離中分離純化出來的。純化出來的。 95kDa，單分子酶，單分子酶， 75 活性最強。活性最強。具有具有 5-3 合成活性和合成活性和 5-3 外切活性外切活性 , 無無 3-5 外切外切活性?；钚浴?5 時半衰期為時半衰期為 40 分鐘分鐘。啟動啟動 PCR 反應的能力很反應的能力很強，聚合速度快，在強，聚合速度快，在 72 的聚合速的聚合速度為每秒度為每秒 3

17、0-100 堿基。堿基。由于沒有由于沒有 3-5 外切活性，在擴增過程中有外切活性，在擴增過程中有 8.9-11x10 -5 的錯配的錯配率。率。（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶來自來自 古細菌古細菌Pyrococcus woesei，由德國寶靈曼公由德國寶靈曼公司開發(fā)司開發(fā)（BM），）， 90kDa ，100 的半衰期大于的半衰期大于 2 小時，小時，具有具有 3-5 外切活性，出錯率低外切活性，出錯率低，使用較多的的且具有高保真度的使用較多的的且具有高保真度的 PCR 酶。酶。 （3）Tth DNA 聚合酶聚合酶來自嗜熱熱細菌（來自嗜熱熱細菌（Thermus thermophilus）

18、 ，由由 Promega 公司開發(fā)成商品。公司開發(fā)成商品。 p 94kDa ，p 95 的半衰期為的半衰期為 20 分鐘分鐘。p 在在 Mg2+ 存在條件下以存在條件下以 DNA 為模板合成為模板合成 DNA ，而在而在 Mn2+ 存在下可以存在下可以 RNA 為模板合成為模板合成 cDNA 。p 因此可在高溫下做因此可在高溫下做 RT-PCR （反轉錄（反轉錄PCR）反反應，應， 避免避免 RNA 反轉錄過程中形成的二級結構。反轉錄過程中形成的二級結構。 （4）C.therm 聚合酶聚合酶 p來自來自Carboxydothermus hudrogenoformans，p以以Mg2+為輔助因子

19、的為輔助因子的逆轉錄酶逆轉錄酶，p最適溫度適最適溫度適60-70 ， p同時也具有同時也具有3-5外切酶校對活性外切酶校對活性，p用于用于RT-PCR 反應。反應。4.2.2 靶靶DNA/模板模板其兩端其兩端20-30bp序列用以一對引物的設計。序列用以一對引物的設計。避免避免引物內部或引物之間存在互補序列（引物內部或引物之間存在互補序列（3個堿個堿基），基），減少引減少引物二聚體的形成以及引物內部二級結構的形成物二聚體的形成以及引物內部二級結構的形成。4.2.3 PCR引物引物引物用引物用核酸序列保守區(qū)內設計核酸序列保守區(qū)內設計并具有并具有特異性特異性，4.2.4 PCR原材料原材料dNTP

20、 脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸4.2.5 PCR緩沖液緩沖液成分：成分：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8室溫下室溫下)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2。Mg2+：是是DNA聚合酶的激活劑，聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。反應體系。Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使Taq酶活性喪失、酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應特異性過高影響反應特異性4.2.6 PCR循環(huán)的溫度和時間循環(huán)的溫度和時間溫度溫度:90-95 模板變性，模板變性，復性（復性（37-60 ），），；70-75 引物在模板上延伸

21、引物在模板上延伸反應時間反應時間變性變性30 s，如果模板，如果模板 G+C 含量高，變性時間可適當延長。含量高，變性時間可適當延長。復性復性30 s。延伸延伸1kb 1 min充足，由擴增產(chǎn)物的大小決定。充足，由擴增產(chǎn)物的大小決定。 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 2535 次。次。25 L PCR反應體系：反應體系：模板模板DNA 1 L （10100ng）引物引物1 1 L （10 mol/L）引物引物2 1 L （10 mol/L）dNTP（ 10 mmol/L ） 1 L （20 mmol/L）10 PCR反應的緩沖液反應的緩沖液 2.5 L Taq酶酶 0.5 L （ 1U/l）ddH2O 補至

22、補至25 L 4.3 PCR擴增擴增DNA片段的方法片段的方法常規(guī)程序常規(guī)程序PCR反應的程序：反應的程序： 溫度（溫度（） 時間（分鐘）時間（分鐘）(1) 95 3-5 (2) 95 0.5(3) 60 0.5(4) 72 1(5) 72 102530個循環(huán)PCR反應的操作注意事項：反應的操作注意事項：1）加樣操作必須在冰上進行；）加樣操作必須在冰上進行；2）加樣的順序：）加樣的順序：（1）從大到??；）從大到小；（2）先加藥品再酶）先加藥品再酶：PCR反應結果異常及解決辦法：反應結果異常及解決辦法：1）無帶；）無帶；2）雜帶多；）雜帶多；3）DNA降解。降解。 PCR中應注意的事項中應注意的事項 防止污染防止污染試劑小量分裝試劑小量分裝吸頭及吸頭及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 設立對照設立對照：陽性對照：陽性對照： 陽性模板陽性模板陰性對照：陰性對照： 陰性模板陰性模板試劑對照：試劑對照： 除模板外的所有組分除模板外的所