純鈦表面淫羊藿苷 TiO2納米管復(fù)合涂層制備與藥物早期釋放的分析

1、www.CRTER.org王非凡，等. 純鈦表面淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層制備與藥物早期釋放的分析純鈦表面淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層制備與藥物早期釋放的分析王非凡1，宋云嘉1，吳文孟1，2，呂武龍1，李 鶯1，李長義1(1天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津市 300070；2越南太平醫(yī)科大學(xué)，越南太平省 33000)引用本文：王非凡，宋云嘉，吳文孟，呂武龍，李鶯，李長義. 純鈦表面淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層制備與藥物早期釋放的分析J.中國組織工程研究，2016，20(43):6416-6423.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.005 OR

2、CID: 0000-0003-2314-9599(李鶯)文章快速閱讀：純鈦表面淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的制備王非凡，女，1991年生，天津市人，漢族，天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院在讀碩士，主要從事口腔種植材料研究。并列第一作者：宋云嘉，男，1990年生，天津市人，漢族，天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院在讀碩士，主要從事口腔種植材料研究。通訊作者：李鶯，博士，副主任醫(yī)師，天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津市300070中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)43-06416-08稿件接受：2016-07-23采用陽極氧化在光滑純鈦表面形成TiO2納米管結(jié)果表明，淫羊藿苷/Ti

3、O2納米管復(fù)合涂層可提供較高的藥物加載量并具有緩釋功能使用高效液相色譜法測定兩種材料的早期藥物釋放量，計算出載藥量，繪制累積釋放量曲線和累計藥物釋放量百分比曲線掃描電鏡、原子力顯微鏡、接觸角測定儀對光滑純鈦及TiO2納米管進行表征通過浸泡法在純鈦及TiO2納米管表面加載淫羊藿苷文題釋義：TiO2納米管：具有很好的機械、化學(xué)性質(zhì)及生物相容性，不僅可促進成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附、增殖和骨向分化，還可吸附并容納藥物，是一種優(yōu)良的局部藥物載體?，F(xiàn)有研究主要集中于在納米管表面加載抗菌藥物或活性成分形成復(fù)合涂層，而納米管表面加載成骨類藥物的報道相對較少。淫羊藿苷：價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定，不但可刺激骨髓

4、間充質(zhì)干細胞中成骨轉(zhuǎn)化因子的活性，誘導(dǎo)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化，還可有效增強成骨功能性標志物的表達：促進骨鈣素分泌，提高堿性磷酸酶活性，刺激型膠原和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子合成等，進而促進成骨細胞的分化和礦化。摘要背景：對純鈦進行表面改性，提高鈦種植體早期骨結(jié)合能力是目前研究的熱點。目的：在TiO2納米管表面加載淫羊藿苷形成復(fù)合涂層，研究其載藥量及早期釋放規(guī)律。方法：通過陽極氧化在光滑純鈦表面形成TiO2納米管，用掃描電鏡、原子力顯微鏡、接觸角測定儀對光滑純鈦及TiO2納米管進行表征。通過浸泡法在純鈦及TiO2納米管表面加載淫羊藿苷，使用高效液相色譜法測定兩種材料的早期藥物釋放量，計算出載藥量，繪制

5、累積釋放量曲線和累計藥物釋放量百分比曲線。結(jié)果與結(jié)論：TiO2納米管徑為80 nm，其粗糙度大于純鈦(P 0.05)，接觸角小于純鈦(P 0.05)；淫羊藿苷/TiO2納米管組前14 d的累計藥物釋放量和前4 h的藥物累積釋放曲線明顯高于淫羊藿苷/純鈦組；與淫羊藿苷/純鈦組相比，淫羊藿苷/TiO2納米管組累計藥物釋放量百分比曲線更為平緩，釋放時間更長；結(jié)果表明，淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層可提供較高的藥物加載量并具有緩釋功能。關(guān)鍵詞：生物材料；緩釋材料；純鈦；TiO2納米管；淫羊藿苷；骨結(jié)合；表征；載藥；浸泡法；藥物釋放；緩釋；國家自然科學(xué)基金 主題詞：鈦；納米管；骨結(jié)合；組織工程基金資助

6、：國家自然科學(xué)基金資助項目(31470920，81500886)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(16JCYBJC28700)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Titanium dioxide nanotube composite coating: preparation and early drug-releaseWang Fei-fan1, Song Yun-jia1, Wu Wen-meng1, 2, Lv Wu-long1, Li Ying1, Li Chang-yi1 (1School of Stomatology, Tianjin Med

7、ical University, Tianjin 300070, China; 2Taiping Medical University of Vietnam, Taiping 33000, Vietnam)AbstractBACKGROUND: The surface modification of pure titanium has become a hotspot for research on improving the early implant-osseointegration ability.OBJECTIVE: To construct the icariin/TiO2 nano

8、tube composite coating, and to explore its drug-loading rate and early drug-release kinetics.METHODS: Pure titanium was anodized to obtain TiO2 nanotube. Thereafter, the pure titanium and TiO2 nanotube were characterized by scanning electron microscopy, atomic force microscopy and contact angle inst

9、rument. Icariin was loaded onto the pure titanium and TiO2 nanotube by immersion method. Afterwards, the early drug-releasing amount of the two materials was measured using high-performance liquid chromatography. Accumulated release and accumulated drug-release percentage curves were drawn.RESULTS A

10、ND CONCLUSION: The diameter of TiO2 nanotube was 80 nm, and the roughness of TiO2 nanotube was significantly higher than that of pure titanium (P 0.05), but the contact angle was significantly lower than that of pure titanium (P 0.05). Moreover, compared with the icariin/pure titanium group, the ica

11、riin/TiO2 nanotube group had obviously higher accumulated drug-releasing amount at former 14 days and accumulated drug-releasing carve at former 4 hours. The accumulated drug-releasing percentage curve in the icariin/TiO2 nanotube group was flatter than that in the icariin/pure titanium group, sugge

12、sting a longer release time. To conclude, the icariin/TiO2 nanotube composite coating has a higher drug, loading and exerts better sustained-release effect.Subject headings: Titanium; Nanotubes; Synostosis; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31470920, 81

13、500886; the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 16JCYBJC28700Cite this article: Wang FF, Song YJ, Wu WM, Lv WL, Li Y, Li CY. Titanium dioxide nanotube composite coating: preparation and early drug-release. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6416-6423.Wang Fei-fan, Studying for maste

14、rs degree, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaSong Yun-jia, Studying for masters degree, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaWang Fei-fan and Song Yun-jia contributed equally to this work.Corresponding author:Li Ying, M.D., Ass

15、ociate chief physician, School of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China6419ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction鈦因其優(yōu)良的機械強度、抗腐蝕性及生物相容性成為種植體的首選材料。但鈦金屬為生物惰性材料，無法與周圍組織直接形成良好的早期骨結(jié)合1。此外，一些代謝性疾病可減慢種植體骨結(jié)合進程，進而導(dǎo)致種植體置入失敗2。因此，對鈦進行表面改性，提高種植體早期骨結(jié)合能力是學(xué)者們研究的熱點。目前對鈦種植體材

16、料進行表面改性的方法主要有機械法(噴砂法3、激光涂覆法4)、化學(xué)法(酸蝕5)、陽極氧化法及涂層修飾法6-7。其中，機械法、化學(xué)法雖可在純鈦表面形成利于骨結(jié)合的超微型結(jié)構(gòu)及化學(xué)表面，然而不能形成可控的表面形貌，并且易在操作中產(chǎn)生殘留物，進而可能影響成骨細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附、增殖、分化等功能。陽極氧化法克服了上述不足，可在表面形成均一、可控的TiO2納米管表面形貌。此外，TiO2納米管構(gòu)與人體骨組織相近，不僅具有很好生物相容性，而且其較高的比表面積還可有效促進成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附攀爬和生長分化8-9。涂層修飾法是在純鈦表面加載具有成骨作用的生物、化學(xué)分子或藥物形成涂層，促進種植

17、體周圍的骨結(jié)合能力。然而涂層與純鈦表面結(jié)合強度較差，易脫落，進而影響其發(fā)揮成骨效應(yīng)。在成骨類藥物中，淫羊藿苷是一種很有應(yīng)用前景的中藥，能調(diào)節(jié)多條信號通路促進成骨，抑制骨破壞10-11，在體內(nèi)前成骨細胞培養(yǎng)條件下和體外骨質(zhì)疏松動物模型中均具有明確的骨誘導(dǎo)作用12-13。將淫羊藿苷負載在種植體表面，有望加快種植體的早期骨結(jié)合過程。實驗的創(chuàng)新性在于，充分利用TiO2納米管優(yōu)良的成骨特性和吸附容納藥物的管狀結(jié)構(gòu)14，將TiO2納米管作為載體，在TiO2納米管表面加載成骨類藥物，形成淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層，不僅使成骨藥物淫羊藿苷因TiO2納米管的承載約束而加載牢固，還可綜合TiO2納米管及淫羊

18、藿苷的促成骨特性，有效地協(xié)同促進種植體周圍骨形成。目前，隨著種植體載藥涂層的研究逐漸深入，藥物釋放性能受到了越來越廣泛關(guān)注。種植后骨結(jié)合是持續(xù)過程，需要種植體載藥涂層緩釋藥物，提供足量的藥物濃度至種植體周圍組織15。因此，測試淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的藥物加載量，研究其緩釋規(guī)律是研究其早期骨誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 隨機分組設(shè)計，對比觀察實驗。1.2 時間及地點 材料制備于2015年4至6月在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室完成，材料表征于2015年7至8月在河北省新型功能材料重點實驗室完成，藥物釋放于2015年8至10月

19、在天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室完成。1.3 材料淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層制備實驗用主要材料及設(shè)備：材料及設(shè)備來源純鈦西北有色金屬研究院淫羊藿苷Sigma 公司，美國高壓直流電源天津市東文高壓電源廠電磁攪拌儀江蘇金壇城西曉陽電子設(shè)備廠鉑電極天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司掃描電鏡Hitachi 公司，日本原子力顯微鏡Agilent公司，美國接觸角測定儀廈門崇達智能科技有限公司，中國高效液相色譜儀Agilent公司，美國1.4 實驗方法 純鈦的預(yù)處理：將40枚直徑1.5 cm的圓鈦片逐級用碳化硅砂紙進行序列打磨拋光至600目。拋光完成后依次用丙酮、無水乙醇及去離子水進行10 min超聲清洗，自然干

20、燥，將處理后的試樣隨機分為純鈦組和TiO2納米管組，每組20枚。 TiO2納米管試樣的制備：將試樣與陽極相連，鉑與陰極相連，放入0.34% HF電解液中，置于電磁攪拌儀中持續(xù)攪拌。在高壓直流電源18 V電壓條件下進行 40 min陽極氧化處理，在試樣表面生成TiO2納米管。制備完成后去離子水進行超聲清洗20 s，干燥后備用。 掃描電鏡觀察：在純鈦組和TiO2納米管組中各隨機選擇5枚，通過濺射鍍膜在試樣表面形成一層薄的金鈀膜，在5 kV的加速電壓下應(yīng)用掃描電鏡采集并記錄試樣的表面形貌。 原子力顯微鏡檢測：采用原子力顯微鏡對兩組試樣的三維結(jié)構(gòu)及納米粗糙度進行表征。在兩組試樣中各隨機選擇10枚，在1

21、1 m2掃描區(qū)域，采用納米探頭以2 Hz的掃描速度與樣品進行接觸檢測，取平均值。 接觸角檢測：在兩組試樣中各隨機選擇5枚，在距離試樣表面5 cm的位置滴加10 L去離子水，通過接觸角測定儀測量去離子水在試樣表面的接觸角，以此反映試樣的親水性，每個試樣測10次，取平均值。 材料表面加載淫羊藿苷：純鈦是公認的生物安全性極好的生物材料，被認為不具有細胞毒性而廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域1。而作為人體置入材料，需要考慮淫羊藿苷的細胞毒性問題。研究預(yù)實驗提示：10-5- 10-9 mol/mL的淫羊藿苷溶液對成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，與以往研究結(jié)果相吻合16-17。預(yù)實驗還測定了在21

22、0-3 mol/mL淫羊藿苷中浸泡所形成的淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的釋放過程濃度，得出在整個釋放過程中，從1-14 d，淫羊藿苷濃度值范圍在10-5-10-8 mol/mL之間。因此研究選用210-3 mol/mL濃度，采用浸泡法加載淫羊藿苷，制備出的淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層。研究采用DMSO溶液將淫羊藿苷配制成 210-3 mol/mL的溶液，將兩組各5個試件分別放入淫羊藿苷溶液中浸泡3 d，然后在空氣中干燥1 d。隨后用移液管吸取500 L PBS快速沖洗表面，移除未與光滑鈦片及TiO2納米管牢固結(jié)合的多余淫羊藿苷，分別制成淫羊藿苷/純鈦組和淫羊藿苷/TiO2納米管組。淫羊

23、藿苷加載量和早期釋放規(guī)律檢測：將沖洗后的淫羊藿苷/純鈦組和負載淫羊藿苷/TiO2納米管組試樣放入24孔板中，分別用500 L PBS浸泡，置于50 r/min的水浴(37 )搖床上。在前4 h內(nèi)，每隔1 h吸出浸泡液并加入500 L新鮮PBS，用高效液相色譜法檢測浸泡液淫羊藿苷濃度。隨后將測量時間間隔延長到1 d，直到所有的淫羊藿苷釋放到PBS中，計算不同時間點釋放劑量的平均值，計算加載量，繪制累計釋放量曲線和累計釋放百分比曲線。1.5 主要觀察指標 兩組試樣表面掃描電鏡、原子力顯微鏡、接觸角檢測結(jié)果，以及淫羊藿苷加載量和早期釋放規(guī)律。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 12.0軟件進行配對t

24、檢驗，P 0.05時提示差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 掃描電鏡觀察結(jié)果 光滑純鈦試樣表面沒有特殊的結(jié)構(gòu)，見圖1A；而陽極氧化后TiO2納米管試樣表面形成了均勻而垂直排列的管狀結(jié)構(gòu)，管徑大致為80 nm，管壁厚度約為10 nm，管間隙約為10 nm，見圖1B。 2.2 原子力顯微鏡觀察結(jié)果 圖2為原子力顯微鏡的三維立體圖，可見純鈦組表面僅可見機械打磨的劃痕，見圖2A；TiO2納米管組表面為凹凸分布的納米級結(jié)構(gòu)，見圖2B。分析得出，純鈦組粗糙度是183.413.8，TiO2納米管組粗糙度是424.620.4，組間比較差異有顯著性意義(P 0.05)。2.3 接觸角檢測結(jié)果分析

25、 經(jīng)過接觸角檢測，純鈦組為(46.35.4)，TiO2納米管組接觸角為(15.84.2)，組間比較差異有顯著性意義(P 0.05)，TiO2納米管組親水性大于純鈦組。2.4 淫羊藿苷加載量和早期釋放規(guī)律檢測結(jié)果分析 圖3為淫羊藿苷/純鈦組和淫羊藿苷/TiO2納米管組在前14 d及前4 h的淫羊藿苷累積釋放曲線。圖3A顯示，淫羊藿苷/TiO2納米管組藥物累積釋放曲線高于淫羊藿苷/純鈦組，經(jīng)計算，前14 d淫羊藿苷/TiO2納米管組藥物累積釋放量為14.68 g，淫羊藿苷/純鈦組為6.85 g，淫羊藿苷/TiO2納米管組的載藥量約為淫羊藿苷/純鈦組的2倍。此外，兩組藥物釋放曲線趨勢相近，可分為快速

26、釋放階段和慢速釋放階段，前4 h為快速釋放階段，兩組試樣的釋放量顯著較高，淫羊藿苷/TiO2納米管組在前4 h中具有持續(xù)較高的釋放量，而淫羊藿苷/純鈦組的釋放量相對不穩(wěn)定，在1 h釋放量較多，隨后明顯下降(圖3B)；在慢速釋放階段，兩組均呈現(xiàn)線性少量釋放，然而淫羊藿苷/TiO2納米管組與淫羊藿苷/純鈦組相比具有更高更穩(wěn)定的藥物釋放量(圖3A)。圖4為兩組在前14 d及前4 h的淫羊藿苷累積釋放百分比曲線。由圖4A可以看到，與淫羊藿苷/純鈦組相比，淫羊藿苷/TiO2納米管組累積釋放百分比曲線更為平緩，提示藥物釋放速度較慢，具有緩釋藥物的能力。以上特征在快速釋放階段(圖4B)表現(xiàn)得更加明顯，淫羊藿

27、苷/TiO2納米管組在前4 h的累積釋放百分比較低且釋放更為緩慢持續(xù)；在慢速釋放階段，淫羊藿苷/TiO2納米管組藥物緩釋一直持續(xù)到第9天，長于淫羊藿苷/純鈦組的5 d(圖4A)。3 討論 Discussion3.1 淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的制備 牙科種植手術(shù)成功的標志是在骨組織與種植體界面形成良好的骨結(jié)合18，然而，鈦材質(zhì)的種植體生物活性較低，置入人體后骨整合時間較長，特別是一些代謝性疾病如糖尿病、骨質(zhì)疏松癥可引起骨結(jié)構(gòu)異常和代謝異常，干擾種植體的早期骨結(jié)合，因此促進種植體周圍成骨是種植術(shù)后的關(guān)鍵問題19-20。TiO2納米管具有很好的機械、化學(xué)性質(zhì)及生物相容性21-24，不僅可促進

28、成骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附、增殖和骨向分化25-28，還可吸附并容納藥物，是一種優(yōu)良的局部藥物載體。現(xiàn)有研究主要集中于在納米管表面加載抗菌藥物或活性成分形成復(fù)合涂層29-32，而納米管表面加載成骨類藥物的報道相對較少33。淫羊藿苷價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定，不但可刺激骨髓間充質(zhì)干細胞中成骨轉(zhuǎn)化因子的活性，誘導(dǎo)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化34-35，還可有效增強成骨功能性標志物的表達：促進骨鈣素分泌，提高堿性磷酸酶活性，刺激型膠原和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子合成等，進而促進成骨細胞的分化和礦化36-37。研究將淫羊藿苷加載至TiO2納米管，制備淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層，使該藥物與TiO2納米管自身的成

29、骨效應(yīng)協(xié)同，進一步加快種植體的早期骨結(jié)合過程。 以往研究表明，直徑為80 nm的TiO2納米管具有更強的親水性，促進成骨細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞黏附效果更佳，成骨作用更強38-39。因此，研究通過預(yù)實驗摸索并調(diào)整陽極氧化參數(shù)，制備出直徑為80 nm的TiO2納米管。藥物加載方法中，浸泡法與化學(xué)偶聯(lián)法或滴覆法相比，操作簡單有效，減少樣本被污染的風(fēng)險40-42。前期實驗發(fā)現(xiàn)，在高濃度浸泡液(210-3 mol/mL)中浸泡后所形成的TiO2納米管載藥復(fù)合涂層，較之低濃度浸泡液(110-3 mol/mL)中浸泡后所形成的涂層藥物加載量較多且分布均勻，藥物釋放時間延長。因此研究應(yīng)用濃度為210-3 mo

30、l/mL的淫羊藿苷浸泡液加載藥物。此外，研究采用原子力顯微鏡和接觸角檢測，結(jié)果顯示：TiO2納米管具有更高的粗糙度、更高的親水性，故TiO2納米管可使藥物溶液更為均勻地鋪展并吸附到試樣表面，具有較高的藥物加載效率。3.2 淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的藥物加載量及早期釋放規(guī)律研究 淫羊藿苷具有優(yōu)良的骨誘導(dǎo)及成骨特性，然而其生物利用度及半衰期較短，半衰期為1.0-2.0 h43，因此需要增加淫羊藿苷的加載量及延長淫羊藿苷的釋放時間，改善生物利用度，更好地發(fā)揮其促進成骨的作用。以往有關(guān)種植體載藥復(fù)合涂層的研究表明：相對于光滑純鈦表面，種植體載藥涂層具有較大的載藥量，并在種植后緩釋藥物，可以給周

31、圍組織提供持續(xù)足量的藥物釋放44。實驗檢測淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的藥物早期釋放量，計算其藥物加載量，分析早期釋放規(guī)律，結(jié)果顯示：與光滑純鈦表面相比，TiO2納米管可提供更高的藥物釋放濃度，具有更大的載藥量，并且釋放速度減慢，具有緩釋效果。該結(jié)果與以往納米管載藥復(fù)合涂層的研究結(jié)果相近。分析淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層的載藥機制，主要是由于TiO2納米管的管狀結(jié)構(gòu)，可提供較大的表面積及體積來吸附更多的藥物到其表層及內(nèi)部45，有效增加藥物加載量。其緩釋效果歸因于TiO2納米管的管狀結(jié)構(gòu)可限制藥物從其表面及管內(nèi)釋出46，減慢釋藥速度，延長釋放時間。故可通過調(diào)整TiO2納米管直徑及長度來獲

32、得較大的載藥量并緩釋藥物，為種植體周圍組織提供持6423ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH累積釋放百分比(%)圖4 淫羊藿苷/純鈦組及淫羊藿苷/TiO2納米管組淫羊藿苷累積釋放百分比曲線Figure 4 Accumulated drug-release percentage curves of icariin/pure titanium group and icariin/titanium dioxide nanotube group圖注：圖中A為前14 d累積釋放百分比曲線，淫羊藿苷/TiO2納米管組累積釋放百分比曲線相比淫羊藿苷/純鈦組更為平

33、緩，淫羊藿苷/TiO2納米管組累積藥物釋放時間為9 d，而淫羊藿苷/純鈦組為5 d；圖B為前4 h累積釋放百分比曲線，與淫羊藿苷/純鈦組相比，淫羊藿苷/TiO2納米管組曲線更為緩慢持續(xù)。B淫羊藿苷/純鈦組淫羊藿苷/TiO2納米管組時間(h)0 1 2 3 4100806040200時間(d)淫羊藿苷/純鈦組淫羊藿苷/TiO2納米管組0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 13 14A累積釋放百分比(%)100806040200BA圖3 淫羊藿苷/純鈦組和淫羊藿苷/TiO2納米管組淫羊藿苷累積釋放量曲線Figure 3 Accumulated release amount c

34、urves of the icariin/pure titanium group and icariin/titanium dioxide nanotube group圖注：圖中A為前14 d累積釋放量曲線，淫羊藿苷/TiO2納米管組藥物累積釋放曲線高于淫羊藿苷/純鈦組；B為前4 h累積釋放量曲線，淫羊藿苷/TiO2納米管組具有持續(xù)較高的釋放量，而淫羊藿苷/純鈦組釋放量相對不穩(wěn)定。時間(h)時間(d)0 1 2 3 4純鈦組TiO2納米管組累積釋放量(g鈦組TiO2納米管組0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 13 14累積釋放量(g)16141

35、21086420圖2 原子力顯微鏡觀察兩組試樣表面形貌的三維結(jié)構(gòu)Figure 2 Three-dimensional surface structure of the two materials under atomic force microscopy圖注：圖中A為純鈦組，可見機械打磨的劃痕；B為TiO2納米管組，可見凹凸分布的納米級結(jié)構(gòu)。BAB A圖1 掃描電鏡觀察兩組試樣表面形貌(6 000)Figure 1 Surface morphology of the two materials under scanning electron microscop (6 000)圖注：圖中A為純鈦

36、組，表面無特殊結(jié)構(gòu)；B為TiO2納米管組，表面為均勻排布的管狀形貌。續(xù)較高藥物濃度，進而增強早期骨結(jié)合能力。淫羊藿苷從TiO2納米管中釋放可分為2個階段：前4 h的早期快速大量釋放階段和隨后9 d的后期慢速微量釋放階段。在快速釋放階段，TiO2納米管表層疏松結(jié)合的藥物依靠與PBS的濃度梯度，通過物理吸附作用從TiO2納米管表層快速大量地溶解釋出，因而形成了早期的藥物快速大量釋放期。在隨后的慢速釋放階段，加載在TiO2納米管深層的藥物憑借擴散作用從管內(nèi)釋放出來47，因此在此階段藥物呈現(xiàn)微量持續(xù)緩慢釋放的特征。在快速釋放階段，淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層對于種植體骨結(jié)合的影響分為2個方面。一方

37、面，涂層中的淫羊藿苷的快速大量釋放可在早期(4 h)為種植體周圍組織提供持續(xù)較高的藥物釋放，使得淫羊藿苷在早期對骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用，促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖并誘導(dǎo)其向成骨細胞分化48-49。研究表明，淫羊藿苷可降低自噬小體的數(shù)量和哺乳動物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-(mammalian microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3-)的水平50；骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化的初期(前3-6 h)可見LC3-的水平銳減和自噬小體的快速降解51，因而骨髓間充質(zhì)干細胞可通過降低初期自噬小體的數(shù)量和LC3-水平而促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成

38、骨方向分化。因此，淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層在前4 h大量快速釋放淫羊藿苷，可降低自噬小體的數(shù)量和LC3-的水平，進而發(fā)揮早期骨誘導(dǎo)作用。此外，骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的初期(前3-6 h)是整個成骨分化的關(guān)鍵窗口期，增強骨髓間充質(zhì)干細胞早期成骨分化還可有效促進后期成骨分化51-52。另一方面，涂層中的TiO2納米管結(jié)構(gòu)，在早期具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞在種植材料表面的黏附和鋪展的作用28，53-54。而早期的細胞黏附可形成細胞骨架和焦點黏附，介導(dǎo)跨膜信號傳導(dǎo)，進而激活后續(xù)調(diào)節(jié)基因表達，啟動后期的細胞生長、分化等活動55-56。研究表明，骨再生區(qū)的骨髓間充質(zhì)干細胞來源廣泛，可來源

39、于其周圍組織(軟組織、骨髓)以及全身周圍組織57；研究還發(fā)現(xiàn)，材料表面的納米級結(jié)構(gòu)可加快全身周圍來源的骨髓間充質(zhì)干細胞在早期募集到種植體周圍58。因而可以推測，淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層種植體在置入頜骨部位后首先直接與周圍的軟組織、骨髓中的干細胞相接觸，隨后又可通過納米級結(jié)構(gòu)和淫羊藿苷的的誘導(dǎo)作用，進一步募集骨髓間充質(zhì)干細胞到受植區(qū)周圍。綜上可知，在快速釋放階段，淫羊藿苷/TiO2納米管涂層快速大量釋放的淫羊藿苷，可發(fā)揮對骨髓間充質(zhì)干細胞骨誘導(dǎo)作用，納米管表面結(jié)構(gòu)在早期可促進骨髓間充質(zhì)細胞和成骨細胞的黏附，兩者在快速釋放階段可協(xié)同增強早期的成骨過程，并有望在骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化

40、的后期起到有效的促進作用。在慢速釋放階段，雖然TiO2納米管藥物釋放速度較慢，但與光滑純鈦表面載藥相比，藥物釋放量更多，并具有緩釋效果，藥物釋放時間一直可以持續(xù)到第9天。有研究表明，當(dāng)淫羊藿苷持續(xù)作用于成骨細胞7 d后，具有明確的促成骨細胞分化及礦化的作用37，59。與此同時，TiO2納米管還具有促進成骨細胞增殖與分化的作用25-26。故淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層在后期仍可以相互協(xié)同，共同促進慢速釋放階段的早期成骨作用，以促進早期骨結(jié)合。綜上所述，淫羊藿苷/TiO2納米管復(fù)合涂層通過在納米管表面加載具有成骨特性的藥物，可分別在快速釋放階段和慢速釋放階段實現(xiàn)協(xié)同作用，促進種植體早期骨誘導(dǎo)作

41、用。與光滑表面直接加載淫羊藿苷的載藥方法相比，該涂層制備方法簡單，載藥量更大，可提供持續(xù)較高的藥物釋放量，并具有早期緩釋功能，進而促進早期骨結(jié)合，具有良好的應(yīng)用前景。致謝：衷心感謝天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室張凱老師，天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室焦建杰老師，為研究的完成提供良好的實驗條件。作者貢獻：實驗設(shè)計、實施及評估由第一作者和共同第一作者共同完成，資料收集由第三作者完成，數(shù)據(jù)處理為第四作者完成，成文為第一作者。利益沖突：所有作者共同認可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：未涉及倫理沖突的內(nèi)容。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核

42、，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者和共同第一作者對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Portan DV,Kroustalli AA,Deligianni DD,et al.On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts.J Biomed Mater Res A. 2012;100 (

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