電子顯微鏡室

1、電子顯微鏡技術(shù)方周溪潘亮亮胡萬里透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡電子顯微鏡室溫州醫(yī)學(xué)院生物學(xué)實驗教學(xué)中心、八、亠冃U言自從光學(xué)顯微鏡出現(xiàn)以后，人類打開了微觀世界的大門，看到了很多用肉眼所 看不到的微小物體，例如細胞、細菌等，使人眼睛的分辨力由0.2mm提高至U 0.2卩m 但是，光學(xué)顯微鏡由于光線波長的限制，它的分辨極限是0.2卩m有效放大倍數(shù)最高不超過2000倍，如果想要看到更小的物體，它就無能為力了。從20世紀30年代開始，人們利用工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，成功地研制了電子顯微鏡， 它的出現(xiàn)，使人們能在超微結(jié)構(gòu)或原子的尺度上觀察研究物體的結(jié)構(gòu)，人們的觀察 從宏觀世界進入了超微結(jié)構(gòu)或原子級的微觀世界。與許

2、多偉大的發(fā)明一樣，電子顯微鏡的發(fā)明，也經(jīng)歷了那個時代艱苦的歷程。 在光學(xué)顯微鏡發(fā)明長達300年的時間里，由于光波波長的限制，直接限制了光學(xué)顯 微鏡的分辨能力，始終難以突破1000倍的放大倍數(shù)。尋找更短波長的光源成為了科 學(xué)家們嘔心瀝血的漫長征程。1924年，法國物理學(xué)家Broglie提出了“電子與光一樣，具有波動性“的假說， 他證明了任何一種粒子在快速運動時，必定都伴有電磁輻射，輻射的電磁波長與粒 子的運動速度成反比，并計算出電磁波長為 0.005nm。1926年，德國科學(xué)家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁場中偏轉(zhuǎn)聚焦的現(xiàn)象， 類似于光線通過透鏡可被聚焦一樣。由此奠定了電子顯微鏡的理論基礎(chǔ)。

3、19281931年間，德國年輕的大學(xué)生Ruska測量了磁透鏡的聚焦特性，并開展 了電子放大成像的研究，終于在 1938年成功研制了世界上第一臺真正的電子顯微 鏡，放大倍數(shù)為1200倍，被譽為電子顯微鏡之父,并在1986年獲得諾貝爾獎。電子 顯微鏡的發(fā)明被譽為20世紀最重要的發(fā)明之一。1939年，德國Siemens公司生產(chǎn)了第一臺作為商品用的透射電鏡，分辨率為10nm 左右。但其體積龐大，無法進一步推廣。20世紀50年代初到60年代末期，電鏡發(fā)展很快，從性能到構(gòu)造都得到很大的 改進，特別是分辨本領(lǐng)得到大幅度提高，達到 1nm左右，到80年代的分辨率已接近 0.1 nm,最新研制的超高壓透射電鏡的

4、分辨率可達 0.005nm。自從1938年第一臺電鏡在德國問世以來，在短短的幾十年時間里，電鏡技術(shù)取 得了飛躍的發(fā)展，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)、地質(zhì)學(xué)、考古學(xué)、天文學(xué)等許多領(lǐng)域 中得到了廣泛的應(yīng)用。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、細胞超微結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科 的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了更適合生物醫(yī)學(xué)研究的新型電鏡。在生命科學(xué)方面，電鏡的應(yīng)用為闡明組織細胞的結(jié)構(gòu)和功能起了巨大的作用， 已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和臨床疾病診斷的重要工具。電鏡核酸原位雜交技術(shù)等；在掃描電鏡常規(guī)技術(shù)基礎(chǔ)上，也出現(xiàn)了冷凍割斷技 蝕刻復(fù)型技術(shù)、管道鑄型技術(shù)、電子探針技術(shù)等。在透射電鏡原有的基礎(chǔ)上安裝各種測試儀器如能譜儀（EDX）、波譜儀（WDX）

5、 出現(xiàn)了各種分析型透射電鏡；還有加速電壓在 200kV以上的高壓電子顯微鏡以隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，電鏡樣品制備技術(shù)也得到飛速發(fā)展。在透射電鏡超 薄切片基礎(chǔ)上，又相繼出現(xiàn)負染色技術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、免疫和細胞化學(xué)技 術(shù)、 術(shù)、 等，及加速電壓在500KV以上的超高壓電子顯微鏡；由于壓電傳感器的發(fā)明，使得機械 探針的定位性增強，出現(xiàn)了掃描探針顯微鏡系列（包括掃描隧道顯微鏡、原子力顯 微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、掃描光子顯微鏡、掃描熱顯微鏡、靜電力顯微鏡等 十幾種類型），其中在生命科學(xué)中應(yīng)用較多的是掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡和激 光掃描共聚焦顯微鏡。第一章透射電子顯微鏡一、與透射電鏡有關(guān)的幾

6、個基本概念1光的衍射現(xiàn)象：由于光具有波動性，當(dāng)光線通過小孔或小 孔光源經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成象會產(chǎn)生衍射。其圖案是 中央部分一個亮斑，在其周圍有明暗交替的園 環(huán)，即埃里（Airy ）圓盤,其中心亮斑的能量大 約占入射光源能量的84% （如圖所示）。2、瑞利準則這二個小孔的衍射圖會重疊在一起。 當(dāng)一個這二個點剛可以分光線通過二個比較靠近的小孔時，衍射圖的中央亮斑正好落在另一個衍射圖的第一暗環(huán)中心時, 辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準則。瑞3、分辨率分辨率又稱分辨本領(lǐng)，它表示儀器的分辨能力足以清 楚分開的兩點或兩個質(zhì)點圓心間最小距離的本領(lǐng)。它與光 的性質(zhì)，即衍射、干涉及透鏡像差有關(guān)?？梢赃@么說，顯微鏡分辯本

7、領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中 央亮斑半徑D （分辨能力）的大小而定： 光學(xué)顯微鏡的分辨力可以根據(jù)阿貝公式來計算，即利準則圖示這里以油鏡為例推算其分辨本領(lǐng)：光的平均波長為入=500nm = 0. 5卩m油的介質(zhì)折射率或系數(shù)N= 1.5物體與物鏡所形成夾角的半數(shù)a <900則中央亮斑的半徑 X 200n m=0.2卩m一般人眼在明視距離250mn處能分辨0.2mm的兩點，油鏡最小能分辨0.2卩m的 兩點，則油鏡理論最大放大能力為：0.2mm/0.2卩m = 1034、電磁波長真空中相對集中并高速運動著的電子流稱為電子束。電子束具有粒子性和波動性，它能產(chǎn)生一定波長的電磁波，其所產(chǎn)生電磁波長由下列公式

8、表示，即：1.226入=護其中入為電磁波長，V為加速電壓。由此可見，電子束的波長完全取決于加速電壓，加速電壓越高，則得到的電子波長越短，得到的分辨本領(lǐng)也就越高。假如一臺電鏡的 V = 50kV 時，則入 0.005nm= 0.000005卩m是光的入=500nm 的10萬分之一，大大減少了衍射光斑D的值。又假如一臺電鏡的點分辨率為 0.1 nm, 那么其理論放大倍數(shù)為0.2mm/0.1 nm = 2x106，而實際有效放大倍數(shù)為1.6x106。我室的H-7500型透射電鏡的點分辨率為0.24nm,則其理論放大倍數(shù)為0.2mm/0.24nm = 0.83x1c6，而實際有效放大倍數(shù)只有 0.6x

9、106。電鏡的分辨率除了受電子束加速電壓高低的影響外，還受很多方面的影響，如 電鏡本身部件的加工精度（各種透鏡尤其是物鏡的質(zhì)量精度）、電鏡的工作狀態(tài)（如 加速電壓、真空度、電鏡的運行模式等）、電鏡室內(nèi)及周邊情況（如濕度、溫度、電 鏡臺的抗震動能力、電磁干擾等）以及樣品制作的質(zhì)量問題（如標(biāo)本的固定情況、 切片厚度、染色反差情況）等。也就是說，一臺分辨力為0.1 nm的電鏡并不能就看清楚0.1 nm大小的結(jié)構(gòu)，可能只看清楚 0.2nm大小的結(jié)構(gòu)。由此可見，電鏡的理論 放大倍數(shù)與實際有效放大倍數(shù)還是有一定的差距的。5、電鏡的像差和畸變電鏡和光鏡一樣，由于光源或透鏡的缺陷，可以發(fā)生各種像差或畸變。 球

10、差：電子束光源通過透鏡受到偏轉(zhuǎn)，通過樣品，從物平面向下發(fā)射，形成 物點孔徑角。從物點發(fā)出的射線，到達下一級透鏡又被聚集。如果透鏡有缺陷或孔 徑角太大，則靠近光軸的射線和遠離光軸的射線，受到電磁場的作用就會不同，這 些射線在光軸上會聚的位置不同，結(jié)果遠離光軸的射線就會在像面上形成一個最小 模糊圈。此時可有圖象中央凸起感。這是目前影響電鏡分辨率的一個主要因素。以致縱向與橫向上的射線。 像散：由于透鏡的磁場強度在縱向或橫向上不同， 聚焦于光軸的位置也有上有下，兩者共同形成一個最小模糊像。 色差：由于電磁波長隨加速電壓而變化，當(dāng)加速電壓不穩(wěn)定時，電子束波長 就可變異，因而發(fā)生類似的像差。 畸變：由于離

11、軸較遠處的徑向磁場的作用力強，使放大倍數(shù)隨物點離軸的距離而變化，進而使圖象發(fā)生改變而產(chǎn)生的。畸變常見的有枕形畸變、桶形畸變和S形畸變等，如下圖所示：r i ITtm6、反差人的眼睛在區(qū)分物體時，主要根據(jù)物體不同部位或物體之間的光強度與波長的 差別，這些差別構(gòu)成了物體的反襯度，又稱為“反差”。電鏡與光鏡一樣也存在反差 現(xiàn)象。由于電鏡標(biāo)本上的不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，疏密度不同，它們散射電子的能 力也各不相同，結(jié)果使透過樣品的電子束發(fā)生疏密差別。散射電子能力強的地方， 透過電子數(shù)目少，因而，熒光屏上所激發(fā)的熒光就弱，顯現(xiàn)為暗像；相反，散射能力弱的地方，透過電子的數(shù)目多，在熒光屏上激發(fā)的光就強，顯現(xiàn)為

12、亮像。因此， 在熒光屏上所看到的是由暗像與亮像組成的具有一定反差的熒光圖像。7、電磁透鏡由于軸對稱彎曲磁場對電子束有聚焦作用，因而可以得到電子光學(xué)像。我們稱 這種具有軸對稱彎曲磁場裝置構(gòu)成的電子透鏡為電磁透鏡（ electron mag netic lenseS。由于電磁透鏡磁場非均勻分布，物、像點在磁場之外，電子在磁場中既受 到軸向分量的作用，又受到徑向分量的作用，使平行于軸進入磁場的電子束可獲得 聚焦（如圖所示）。二、電鏡與光鏡的成像原理透射電鏡是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣、分辨本領(lǐng)最高的電鏡，用于病理診斷主要也 是這種電鏡。電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的基本原理是相同的，不同的是光鏡的照明源是可見 光

13、，而電鏡是用電子束照明。光鏡的透鏡用玻璃制成，電鏡的透鏡是軸對稱的電場或磁場。光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進行折射，將一物點發(fā)出不同角度的光 線最終會聚成一個像點。0電子顯微鏡是以電子束作為光源，利用電磁透鏡產(chǎn)生的電場或磁場折射電子束, 并通過電子束轟擊熒光屏激發(fā)熒光而達到成像目的（如圖所示）LVJ電子顯微鏡成像示意圖光學(xué)顯微鏡成像示意圖L三、透射式電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)透射式電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）由 四部分組成，即電子光學(xué)系統(tǒng)（即鏡筒）、真 空排氣系統(tǒng)、電源系統(tǒng)和水冷系統(tǒng)。（一）、電子光學(xué)系統(tǒng)（如圖所示）：是電鏡 的主體，主要作用是成像和放大。它包括照明 系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)和觀察記

14、錄系統(tǒng)等四 部分。1、照明系統(tǒng) 照明系統(tǒng)相當(dāng)于光鏡的光源和反光鏡，其作用是產(chǎn)生對樣品照明的電子束，主要組成如 下：（1）電子槍 是電子發(fā)射源，由陰極、控制極和陽極組成。其中陰極是用直徑 0.1mm- 0.15mm粗的鎢絲制成，呈V字形，也稱燈絲。 當(dāng)通電達一定溫度時，即產(chǎn)生熱電子發(fā)射，形 成強的照明電子束?？刂茦O即韋氏極（Wehnelt） 又稱柵極，位于陰極和陽極之間，它的電位也 比陰極低，起著控制電子束發(fā)射及改變電子槍JnsiSS-WL2雅IfA JttftJtW5 ift=*3EnOr 二rrnriny iKi鏡筒結(jié)構(gòu)示意圖中電場分布的作用，使陽極發(fā)出的電子束聚攏成束而不發(fā)散。陽極是一個中

15、間帶孔 的金屬圓帽，位于陰極的對面，它形成強大的正電場，與陰極之間有40千伏120千伏的電位差，這一負高壓用以加速由陰極發(fā)射的電子束穿過其中心小孔，繼續(xù)飛向后續(xù)光路中的聚光鏡，使電子束更加密集，從而產(chǎn)生更強的照明效果。（2） 聚光鏡 是將來自電子槍的電子束會聚在樣品上，對樣品進行照明。高分辨 率的電鏡有兩個聚光鏡，在第二聚光鏡中裝有活動光闌 （用白金片做成），上面有3 4個光闌孔，不同型號的電鏡，其光闌孔也有不同，一般有直徑為100 m 200卩m、 300卩m和400卩m的圓孔，禾U用光闌孔的大小，可以控制聚光鏡的孔徑角，即控制 照明束的強弱，調(diào)節(jié)照明亮度，使樣品不致發(fā)生過熱現(xiàn)象，從而取得比

16、較理想的圖象清晰度。聚光鏡的中心位置還有一個極靴（Pole piece ），其作用是籍以增強磁 場強度，使電子束進一步聚攏。而磁場強度則又決定于所加電流的大小，故可通過 改變電流大小來調(diào)節(jié)磁場強度，以達到根據(jù)需要調(diào)節(jié)放大倍率和對所形成圖象進行 調(diào)焦的目的。2、樣品室樣品室是放置樣品用的，通過特殊的機械裝置更換樣品。另外，通過連動裝置，在真空外可以操縱樣品臺在 X、Y軸方向上移動，可分馬達驅(qū)動和手工驅(qū)動兩種，從 而為尋找目標(biāo)圖象提供方便。3 、成像系統(tǒng)（1）物鏡 是電鏡中第一個成像的透鏡，要求有極高的加工精度及穩(wěn)定性，以 保證成像質(zhì)量。物鏡同樣裝有精密度極高的極靴以及要求極高的消像散器，以盡量

17、消除像散（astigmatism），以保證成像的清晰度。物鏡同樣裝有活動光闌，可提高反 差。光闌孔的大小與物鏡成像的孔徑角和成像的反差強弱有關(guān)。所選的光闌孔徑越 小，其成像的反差就越強，但由于此時通過的電子束也就越小，故其照明度也越低。因此，要想得到良好的圖象效果，必須選擇合適的光闌孔徑。（2）中間鏡 是一個可改變放大倍數(shù)的弱透鏡， 主要用于控制總放大倍數(shù)。如 果一個中間鏡不能滿足要求時，還可用兩個甚至三個中間鏡來控制放大倍數(shù)。（3）投影鏡 是將中間鏡所成的像進一步放大并投影到熒光屏上，以供觀察。 和物鏡及中間鏡比較，投影鏡的電流一般是不變的，即其放大倍數(shù)是固定的。一般 性能較好的電鏡往往裝有

18、兩個以上投影鏡。4 、觀察及記錄系統(tǒng)包括觀察室和底片室。觀察室內(nèi)有熒光屏，在電子束的照射下，樣品的電子顯 微像即在熒光屏上顯示。底片室位于熒光屏的下面，需要照相時，可將熒光屏移開， 使電子束直接作用于底片，圖象即記錄在感光底片上。（二）真空排氣系統(tǒng)真空系統(tǒng)由機械泵、油擴散泵、真空管道、閥門及檢測系統(tǒng)組成。其作用是排 除鏡筒中的空氣，使鏡筒達到高真空狀態(tài)。否則，電子槍發(fā)射的高速電子會與氣體 分子發(fā)生碰撞，產(chǎn)生電子散射，影響像的質(zhì)量和反差；此外，在電子槍中會產(chǎn)生高 壓放電，氣體會腐蝕燈絲，影響燈絲壽命，還會污染樣品。（三）電源系統(tǒng)電鏡所用的電源比較復(fù)雜，同時對電源的穩(wěn)定性要求很高。在總的電源的供給

19、 上要求用專用線，對電源要先進行交流穩(wěn)壓，然后再進行整流、直流穩(wěn)壓，這部分 工作一般在電源箱內(nèi)完成，最后供給各部分使用。主要的電源供給包括高壓電源、 電子槍燈絲電源、控制極電源、透鏡電源、真空系統(tǒng)電源等部分。（四）水冷系統(tǒng)由于電鏡工作時會產(chǎn)生熱量，尤其是電子槍和電磁透鏡部分產(chǎn)生的熱量最多， 如果不及時散發(fā)或冷卻下去，會造成電鏡工作不良，甚至影響電鏡壽命。水冷系統(tǒng) 主要靠冷卻水循環(huán)裝置來完成或者直接用自來水降溫，不過用自來水往往降溫不穩(wěn) 定。第二章超薄切片技術(shù)由于普通電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，只有在高真空條件下才能達到一定的自由行程，所以 電子顯微鏡所觀察的樣品必須很薄，一般的加速電 壓在l

20、OOkV左右的透射電鏡其標(biāo)本厚度不要超過 lOOnm,超高壓電鏡的標(biāo)本切片厚度可以達到 1卩 因此，大家習(xí)慣把切片厚度在1卩m以下的薄片稱為 超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50-9 One 在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù) 是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片過程相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、 浸透、包埋、聚合、切片及染色等步驟。但是，由于電鏡的高分辨本領(lǐng)以及電子束 的照射很易使樣品發(fā)熱變形，因此對超薄切片技術(shù)提出了更高的要求。為了獲得理 想的超薄切片，除了擁有高性能的超薄切片機以及操作者嫻熟的切片技術(shù)外，每個 操作者必須十分認真地對待樣品制作的每一個步驟

21、，任何環(huán)節(jié)的疏忽都有可能使制 片失敗。、透射電鏡樣品制作流程:取材一一漂洗（生理鹽水）一一前固定（2.5%戊二醛，4dC冰箱2小時以上） 漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）一一后固定（1%鋨酸1小時左右）一一 漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）一一塊染（1%醋酸鈾2小時）一一梯度 脫水（50%、70%、80%、90%丙酮各15分鐘，100%丙酮2次，各10分鐘） 浸透（丙酮：包埋液=1 ： 1, 37 OC烘箱2小時；丙酮：包埋液=1： 4， 37dC烘箱過 夜；純包埋液45cC烘箱2小時）一一包埋聚合（45（C烘箱3小時，65dC烘箱48小 時）。T-詞13-、E-aI1電l

22、a-UftR訂耳IJ.社 I1札*境E_u*d阿JR片1附錄：超微病理標(biāo)本微波快速制備流程:取材（按常規(guī)要求方法）一一3%戊二醛固定后經(jīng)微波高火照射 20秒，室溫繼續(xù) 固定20分鐘一一1%磷酸緩沖液漂洗4次，每次5分鐘，微波中火照射20秒一一1% 鋨酸微波中火照射10秒，室溫繼續(xù)固定20分鐘一一丙酮50%、70%、80%、90% 脫水，微波中火照射20秒，室溫繼續(xù)脫水2分鐘。100%丙酮脫水3次，每次微波 中火照射20秒，室溫3分鐘一一丙酮：包埋劑=1： 1浸透，微波中火照射20秒， 室溫繼續(xù)浸透5分鐘一一丙酮：包埋劑=1： 3浸透，微波中火照射20秒，室溫繼續(xù) 浸透5分鐘，2次一一純包埋劑微

23、波中火照射 20秒，室溫10分鐘一一常規(guī)包埋一 聚合：70r 20分鐘，95r 30分鐘，110C 60分鐘一一半薄切片光鏡定位一一 超薄切片一一醋酸鈾微波中火照射染色 30秒，雙蒸餾水漂洗一一枸櫞酸鉛微波中火 照射染色20秒，雙蒸餾水漂洗一一45r烘箱干燥一一電鏡觀察。注意：高火：600 800W ;中火：約400W。二、取材（一）取材的基本要求組織從生物活體取下以后，如果不立即進行適當(dāng)處理，就有可能出現(xiàn)缺血缺氧 改變，或細胞出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象，從而出現(xiàn)了人為假象，影響觀察結(jié)果，甚至導(dǎo)致無法觀察。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細胞的微細結(jié)構(gòu)遭受破 壞。因此，為了使細胞結(jié)構(gòu)盡可能保持

24、生前狀態(tài)，希望取材操作者應(yīng)注意“快、小、 冷、準”四個取材要點：（1）.快：就是取材動作要迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時間（爭取在12分鐘之內(nèi)）投入前固定液。對于實驗動物，最好在斷血流、斷氣之前就進行取材，以免 缺血缺氧后使細胞代謝發(fā)生改變而破壞細胞的超微結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，最好是采用灌注固 定法。.?。河捎诔Ｓ玫墓潭▌B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到 良好的固定。因此所取組織的體積要小，一般不超過1mm為便于定向包埋，可將組織修成大小約1mM 1mrK 2mm長條形。.冷：為了防止酶對自身細胞的酶解作用，取材操作最好在低溫 （0 C4C）下進 行，這樣可以降低酶的活性，防止細胞自溶

25、。但也有人認為，如果環(huán)境溫度在 15C 以下，可以在室溫下進行取材，效果也不錯。（4）.準：就是取材部位要準確，這就要求取材者對所取的組織解剖部位要熟悉，盡 量取到與實驗要求相關(guān)的部位，不同實驗組別間要取相同部位，同時作好定向取材。 詳見不同組織器官的取材方法一章。此外，還要求操作動作輕柔，熟練，盡量避免牽拉、挫傷與擠壓對組織造成的 人為損傷。（二）取材方法首先，實驗者要預(yù)先準備好平皿、碎冰或冰袋、蠟板、固定液、鋒利的刀片、 干凈的小玻璃瓶若干個等取材物品。取材之前先在蠟板（用切片石蠟置培養(yǎng)皿中溶 解后再冷卻即可）上滴12滴預(yù)先在4C冰箱內(nèi)冷卻的固定液（一般為 2.5%或3% 磷酸緩沖液緩沖的

26、戊二醛），將取出的組織放在固定液當(dāng)中，用新的、鋒利的刀片 采用雙刀拉鋸法，將組織塊盡量修小，一般不超過Imm或者可將組織修成大小約ImrK ImrK2mm長條形，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中（組織塊體積與固定液體積之比大約為 1: 40），然后在瓶子上做好標(biāo)簽或標(biāo)記， 避免組織混淆不清。如果組織帶有較多的血液或其它組織液，應(yīng)先用生理鹽水或直 接用固定液漂洗幾遍，然后再照以上方法切成小塊進行固定。以下為雙刀拉鋸法取材示意圖：9#空*乞一刀片拝品牙科蠟板一碎冰二.固定固定的目的是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并 且牢固地固定在它們原來所在的位置上。固定

27、的方法有物理的和化學(xué)的兩大類。物理的方法系采用冰凍、干燥等手段來保持細胞結(jié)構(gòu)；化學(xué)的方法是用一定的化學(xué)試 劑來固定細胞結(jié)構(gòu)。下面主要介紹固定液特性以及使用化學(xué)方法對組織或細胞進行固定的方法。（一）常用固定劑的性質(zhì)1 四氧化鋨（osmium tetroxide , 0s04）四氧化鋨又名鋨酸，是一種淡黃色、具有強烈刺激味的晶體。它是強氧化劑， 與氮原子有較強的親和力，因而對于細胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。 它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使 生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNARNA及糖原。四氧化

28、鋨固定劑有強烈的電子染色作用，用它固定的樣 品圖象反差較好。四氧化鋨的缺點是滲透能力較弱，每小時僅滲透 0.1mm- 0.3mm用四氧化鋨固 定的時間一般為2小時左右，長時間停留在四氧化鋨溶液中會引起一些脂蛋白復(fù)合 體的溶解，而使組織變脆，造成切片困難。四氧化鋨容易蒸發(fā)，其蒸氣對皮膚、呼 吸道粘膜及眼睛角膜有傷害作用。因此，使用時要注意通風(fēng)，操作宜在通風(fēng)櫥中進 行。因受熱或可見光會促使四氧化鋨氧化，故應(yīng)保存于避光和陰涼處。2. 戊二醛（glutaraldehyde C5H8O2）戊二醛于1963年開始采用，是當(dāng)前廣泛使用的固定劑。戊二醛的優(yōu)點是對糖原、 糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)等有較好的

29、固定作用，對組織和細胞的穿透力比 四氧化鋨強，還能保存某些酶的活力，長時間的固定（幾周甚至12個月）不會使組 織變脆。缺點是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對細胞膜的顯示較差。商品戊二醛通常為25%勺水溶液。大多數(shù)市售戊二醛水溶液含有雜質(zhì)，主要是 戊二酸、丙烯酸等，它們可以影響固定質(zhì)量，尤其對酶的保存。因此要獲得好的固 定，可對市售戊二醛用活性碳或用蒸餾方法進行提純。一般戊二醛的pH為4.05.0，貯存時間過長時，溶液顏色變黃，酸度增加，當(dāng) pH降至3.5以下就不能使用。戊二 醛原液應(yīng)在冰箱保存。3. 甲醛甲醛分子量較小，在組織中滲透快，固定迅速，對細胞精細結(jié)構(gòu)的保存雖不如 戊二醛，但在酶活性

30、的保存上卻優(yōu)于戊二醛，故多用于細胞化學(xué)或快速固定。一般市售的甲醛溶液中含有抗聚合的甲醇，影響固定效果，因此，固定電鏡樣品所用的甲醛應(yīng)在臨用前用多聚甲醛粉末制備。配制10%多聚甲醛溶液方法如下：10克多聚甲醛粉末加入100毫升雙蒸水，加熱至60C70C,邊攪拌邊加入幾滴1N NaOH，至溶液透明，冷卻后備用。（二）常用固定方法1. 浸泡固定（也稱組織塊固定）：就是將組織塊直接浸泡入固定液當(dāng)中進行固定， 常規(guī)采用戊二醛一鋨酸雙重固定法。1.1.預(yù)固定（或前固定）用2%4%t二醛固定液，或者2%多聚甲醛+ 2.5%戊二醛混合固定液固定24 小時，pH值為7.37.4，溫度為4C。固定液的用量為標(biāo)本的

31、40倍左右。1.2緩沖液漂洗漂洗時間0.52小時（4 C），若戊二醛固定時間延長，漂洗時間亦需相應(yīng)延長， 以徹底洗去戊二醛殘液。在漂洗期間，注意要換液數(shù)次。所用的組織漂洗液一般為 同系列緩沖液。1.3后固定用1%鋨酸固定液固定12小時（4 C） , PH7.37.4。固定完畢，用緩沖液漂洗 20分鐘后進行脫水。2. 游離細胞的固定適用于培養(yǎng)細胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng) 細胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細胞脫離管 壁。取培養(yǎng)細胞、抗凝靜脈血、骨髓或其他標(biāo)本24ml,放細口徑試管中離心，1500 2000轉(zhuǎn)/分，1015分鐘；接著用滴管吸

32、去上清，沿管壁緩慢加入 2%3%t二醛固 定液，靜置30分鐘，4C冰箱保存。如為周圍血或骨髓，用細針小心將紅細胞上面的薄層淡黃色膜（含白細胞及血小 板等成分）取出，并切成小塊。如為培養(yǎng)細胞及胸腹水，則將沉在試管底部的細胞團塊取出，加入血清或抗凝 血漿進行混合預(yù)包埋，同時加戊二醛固定 60分鐘以上。然后進行緩沖液漂洗 3次， 每次大約15分鐘，最后用1%鋨酸固定液固定1530分鐘。3. 原位固定法就是在組織未取下之前，在組織器官原來的位置進行預(yù)固定的方法。原位固定 可分為點滴固定法和注射固定法兩種。點滴固定法：就是將實驗動物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剝開包膜，將預(yù)冷的固定液直接滴在組織的

33、表面上，并保持固定液適當(dāng)濃度不使揮發(fā)干燥。注射固定法：就是將實驗動物麻醉后，將固定液用細注射針直接注射到所需固 定的組織中或空腔臟器的內(nèi)部。經(jīng)過以上方法處理后，取下所需組織，依照浸泡固定方法進一步固定。該方法 適用于一些比較軟或易碎的組織如眼睛、腦和睪丸。3. 灌注固定法這是最好的固定方法。它是利用血液循環(huán)的途徑將固定液灌注到所需固定的組 織中，其特點是灌注快速、均勻，缺點是固定操作復(fù)雜、要求高。灌注固定法可分為全身固定和局部固定兩種。通常采用的固定劑為2%4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。以下介紹具體灌注固定方法，以供大家參考。在進行灌注固定之前首先用3.5%水合氯醛（按35mg/100g

34、體重）或者戊巴比妥 鈉（50mg/100g體重）進行腹腔麻醉動物。對于進行全身固定的動物，打開胸腔， 暴露心臟；對于局部固定的動物，暴露所需固定的器官的動脈。接著將灌注頭插入 左心室或相應(yīng)器官的動脈血管，先用生理鹽水灌注，灌注的同時用眼科剪刀剪開右 心房或相應(yīng)的回流靜脈，使得循環(huán)通暢。當(dāng)流出的液體清亮不含血液時（大約需要 2分鐘左右），換固定液進行灌注固定，一般灌注固定時間在10分鐘一15分鐘，而后采用浸泡固定法進行后續(xù)處理。灌注固定期間需要注意的是，灌注壓力不要太高（具體見附表）；灌注液溫度 接近25C30C；血管穿刺要一次性完成，避免引起血管收縮；注意防止血液凝固， 可在穿刺之前在腹腔注射

35、0.4ml肝素。局部灌注固定的器官為肝、胃腸道、腎、骨髓和睪丸等，灌注位置開在腹主動 脈，以腎靜脈或髂靜脈作為回流出口；腦組織的灌注位置在頸動脈，以頸靜脈或右 心房作為回流出口。附表局部灌注時灌注壓力和流量臟器灌注壓力（kPa）灌注流量（ml/min ）肝、胃腸道16.0 18.7910腎16.0 18.7910骨髓24.0 26.711 12睪丸26.7 29.312 13腦18.0 20.510 11三.脫水為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即 用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急 驟的脫水會引起細胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯

36、度進行：70%丙酮15分鐘，80%丙酮15分鐘，90%酮15分鐘，100%!酮1 0分鐘（二次）。游離細胞可適當(dāng)縮短脫水時 間。過度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會使樣品發(fā)脆，造成切片困難。四. 浸透和包埋浸透就是利用脫水劑稀釋包埋劑，并最終讓包埋劑完全滲入到組織內(nèi)部取代脫 水劑的過程。包埋就是將浸透好的組織放入特定的包埋模內(nèi)，加入包埋劑再加溫聚合成硬塊 的過程。理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：.粘度低，容易滲入組織，并與脫水劑相混溶；.聚合均勻而充分，聚合前后體積變化?。?有良好的切割性能； .能耐受電子束轟擊，高溫下不變形，不升華； .對細胞成分抽提少，微細結(jié)構(gòu)保存良好； .在電鏡的高倍放大

37、下，本身不顯示任何結(jié)構(gòu)； .材料來源豐富、易得，價格低廉，對人體無害。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂（epoxy resin）。環(huán)氧樹脂是一類高分子聚合物， 它的分子中含有兩種反應(yīng)基團，即環(huán)氧基和羥基。當(dāng)加入酸酐類時，樹脂分子中的 羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接，這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做 硬化劑，它們參與交聯(lián)反應(yīng)，并被吸收到樹脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀 酸酐（或叫十二碳烯基丁二酸酐，簡稱 DDSA）甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐（或叫六 甲酸酐，簡稱MNA及順丁烯二酸酐等。當(dāng)加入胺類時，就引起末端環(huán)氧基相連，形 成首尾相接的長鏈狀聚合物。這種促進末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑

38、。常 用的加速劑有2,4,6 三（二甲氨基甲基苯酚,簡稱DMP-30）二乙基苯胺及乙二胺 等。為了改善包埋塊的切割性能，某些環(huán)氧樹脂包埋劑配方中還加有增塑劑，使包 埋塊具有適當(dāng)?shù)捻g性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯（簡稱DBP）b目前國內(nèi)外普遍采用的包埋劑為 Epon-812環(huán)氧樹脂，它是一種進口的環(huán)氧樹 脂，其粘度較低，25C時為150210厘泊，聚合前后體積變化小（收縮率為2%-5%）, 切片在電子束照射下比較穩(wěn)定，能較好地保存細胞的微細結(jié)構(gòu)。但操作條件要求較 嚴格，如組織塊脫水要徹底，包埋時要注意防潮及防止氣泡產(chǎn)生，聚合時溫度要控 制好等。浸透包埋過程如下：預(yù)先按一定比例將Epon-81

39、2環(huán)氧樹脂、MNADDSA以及加速劑混合均勻的包埋 劑準備好。將充分脫水干凈的組織浸入脫水劑與包埋劑混合液（脫水劑：包埋劑=1：1）浸透2小時，再浸入脫水劑與包埋劑混合液（脫水劑：包埋劑 =1： 4）浸透過夜， 第二天將組織浸入純包埋劑 23小時。常規(guī)包埋在一次性包埋膠囊或特制的定向橡膠模板中進行。首先將膠囊或包埋 模置烤箱烘干。用鑷子或牙簽將組織塊放置膠囊底部或橡膠模板中，將包埋液加入 包埋?；蚰z囊中，放上標(biāo)簽，在 45r （36小時）、60r （3648小時）烤箱內(nèi)加溫， 即可聚合硬化，形成包埋塊。包埋操作中應(yīng)注意以下幾點：（1）所有試劑要防潮，最好存放在干燥器中；（2） 所用器皿應(yīng)烘干；

40、（3）配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；（4）包埋時動作要 輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；（5）皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；（6）盛放過包 埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈。五. 超薄切片（一）超薄切片前的準備工作1修塊一般用手工對包埋塊進行修整。將包埋塊夾在特制的夾持器上，放在解剖顯微 鏡下，先用鋒利的刀片削去或用砂紙磨去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的 四周以和水平面約成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。2 .半薄切片光鏡定位一般使用玻璃刀在超薄切片機上切出厚度為 0.5 葉1 口的切片，稱厚片或半薄 切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加 溫，使

41、切片展平，吸干或自然干燥后經(jīng)甲苯胺藍染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察定位。半薄切片進行光學(xué)顯微鏡觀察的目的：（1）定位：對于超薄切片來說，包埋塊 中的組織面積還嫌大，還需要修小，如果盲目地修小，就有可能把要觀察的部分修 掉，因此要切厚片用光學(xué)顯微鏡觀察，以便準確定位，保留要用電鏡觀察的部分， 修去其余部分。（2）便于對同一組織的同一部位進行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對比觀察。 半薄切片定位以后，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形， 頂面修成梯形或長方形（最好是梯形），每邊的長度不超過0.2m葉0.3mm為宜。3制刀超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，一種是鉆石刀。由于玻璃刀價格便 宜，使用

42、者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，厚度為5mmr 6.5mm玻璃刀制作可用專門制刀機制備。制刀時，先將玻璃條清洗干凈，按照制刀機 的操作程序進行制刀，制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片 漂浮在水面上。水槽有樹膠水槽和膠布水槽兩種。樹膠水槽有固定的形狀，可反復(fù) 使用。膠布水槽是臨時用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟圭寸 固接口，防止漏水。金剛刀極其鋒利，能夠迅速切出高質(zhì)量的超薄切片，節(jié)省了大量的時間。但其 價格昂貴，使用時一定要極其小心，一旦操作失誤，損傷了刀口，將帶來巨大損失。 這要求操作者必須有深厚的切片功底和技巧，才能延長金剛刀的使用壽命。4載網(wǎng)和支持膜電鏡

43、中使用的載網(wǎng)根據(jù)所用材料不同可有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)、鈦金網(wǎng)等， 一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑 3mm網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、橢圓形等。根據(jù)網(wǎng)孔的數(shù)目可分為單目、雙目、50目、100目、200目、300目等多種規(guī)格，可根 據(jù)需要進行選擇。支持膜的制備：挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度 為10nm20nm對支持膜的要求是透明無結(jié)構(gòu)，并能承受電子束的轟擊。常用的支 持膜有火棉膠膜及聚乙烯醇縮甲醛膜（Formvar膜）兩種，本室采用后者。（二）超薄切片超薄切片需用超薄切片機進行。根據(jù)推進原理不同，將超薄切片機分為兩大類： 一類是機械推進式切片機，用微動螺旋和微動

44、杠桿來提供微小推進；另一類是熱脹 冷縮式切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進。超薄切片的步驟包括：（1）安裝包埋塊；（2）安裝玻璃刀；（3）調(diào)節(jié)刀與組織塊的 距離；（4）調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置；（5）調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片；（6） 將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。六. 超薄切片的染色未經(jīng)染色的超薄切片，反差很弱。因此，要進行染色處理，以增強樣品的反差。 一般是用重金屬鹽與組織細胞中某些成分結(jié)合或被組織吸附來達到染色的目的。重 金屬的原子對電子束形成散射，從而提高圖象的反差。常用的染色劑有醋酸鈾和檸 檬酸鉛。染色方法有兩種：1. 組織塊染色在脫水至70匯醇或丙酮時，將

45、組織塊放在用70聽醇或丙酮配制的飽和醋酸鈾 溶液中，染色時間2小時以上，或在冰箱中過夜。2. 切片染色由于生物材料都是由氫、碳、氮、氧、磷等具有很小原子序數(shù)的物質(zhì)組成，這 些物質(zhì)對電子透射能力和散射能力基本一樣，這樣所產(chǎn)生圖象的反差是很弱的，因 此超薄切片必須經(jīng)過重金屬處理，這樣才可以增強切片反差、提高分辯率。由于被 染色標(biāo)本的不同結(jié)構(gòu)成份對重金屬的結(jié)合量不同，染色處理后重金屬密度高的部分 因散射掉的電子較多，在熒光屏上觀察顏色也就較深，這樣可獲得反差對比良好的 圖象。常用的重金屬為鉛和鈾。具體染色步驟如下：預(yù)先取一個清潔的培養(yǎng)皿，內(nèi)放干凈的牙科用的石蠟片。 染色時，加數(shù)滴染液于蠟片上，用鑷子

46、夾住載網(wǎng)的邊緣，把貼有切片的一面朝下， 使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿，染色1020分鐘。載網(wǎng)從染液中取出后，必須盡 快用重蒸餾水清洗干凈。在染色過程中，鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成 碳酸鉛顆粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液時，要盡量減少與空氣的接觸。 為防止鉛沉淀污染，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放置氫氧化鈉丸，以吸收空氣中的二氧化碳。七、電鏡觀察、拍片、記錄電鏡觀察之前必須做好電鏡的調(diào)試工作， 包括鏡筒合軸（如電子槍平移與傾斜、 聚光鏡平移與傾斜、聚光鏡光闌選擇與對中、聚光鏡消像散、物鏡光闌選擇與對中、中間鏡對中、投影鏡對中等）、物鏡消像散、裝樣品等步驟。這些步驟非常重要， 如果調(diào)節(jié)不好，會直

47、接影響電鏡觀察的圖象質(zhì)量。還有，由于底片在生產(chǎn)、運輸、儲存過程中會潮，底片使用之前必須在預(yù)抽氣 泵或預(yù)抽氣室中被抽氣，時間不小于 12小時。電鏡具體操作規(guī)程見附錄6 7。對于電鏡觀察者來說，首先，觀察者要熟悉電鏡的基本操作程序以及所要觀察 材料的相關(guān)知識，在進行電鏡觀察之前，觀察者必須事先接受電鏡上機操作培訓(xùn)， 當(dāng)取得上機操作合格證以后方可上機操作。其次，做好觀察記錄，選好范圍拍片，準確記錄底片號碼及相應(yīng)內(nèi)容。最后，做好各種資料的整理、備案工作。八、暗室工作流程當(dāng)電鏡觀察完畢后，取出拍攝的底片送到暗室進行顯影、定影、干燥、拍照等 一系列操作。操作之前必須配好顯影液、定影液，準備好按一定規(guī)格裁制

48、的照相紙 備用。整個操作過程必須要在紅色或綠色安全燈下工作。首先是底片沖洗：顯影：依次將底片放入裝有顯影液的顯影罐或顯影盤內(nèi)，一次不超過4張底片，最多不要超過6張（特制的顯影罐除外），同時不停地用底片夾夾住底片輕輕地攪動。 在液溫20C的情況下，一般顯影4-6分鐘。停影：就是將顯影后的底片在清水中進行漂洗，一般5秒左右。定影：依次將底片放入裝有定影液的定影罐或定影盤內(nèi)，同時不停地用底片夾夾 住底片輕輕地攪動，待乳白色物體完全溶解，底片透明為止。在液溫14-24C的情況 下，一般定影4-6分鐘。水漂：將定影好的底片依次放入漂洗盤中，在流動的水中漂洗30分鐘（此步驟可在亮室里工作）。晾干或烘干：用

49、小夾子將底片夾住，在空氣中自然晾干或者在特制的底片烘箱中 進行烘干。照片沖?。浩毓猓嚎梢栽谡掌糯髾C中暴光或翻拍箱中翻拍，視底片具體情況，確定曝光時間，一般暴光在4秒左右。使用的照片紙最好用光面涂塑放大紙。顯影、停影、定影、水漂、晾干或烘干等操作基本同底片操作。備注：每1000毫升顯影、定影液可顯、定影數(shù)量約 100張左右。第三章電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù)細胞化學(xué)的種類很多，有離子細胞化學(xué)、核酸細胞化學(xué)、酶細胞化學(xué)等，它們 的分布都有其特定的超微結(jié)構(gòu)位置。這里主要介紹電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù)。酶存在的特定位置稱為酶的定位。酶的細胞化學(xué)技術(shù)就是通過酶的特異性細胞 化學(xué)反應(yīng)來顯示酶在細胞內(nèi)的定位，對于酶的細胞化

50、學(xué)來說，酶的特異性是很重要 的。電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù)是在光鏡細胞化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的一門技術(shù)，到 目前為止，能在電鏡下定位的酶有 100多種，主要通過酶的活性作用結(jié)果間接地證 明酶的存在。一般先將酶原位固定在細胞內(nèi)，再使它與特定的底物起反應(yīng)，底物的 分解物經(jīng)過捕捉反應(yīng)沉著于發(fā)生分解的原位上，最后使沉著物變?yōu)樵陔婄R下可以看 到的物質(zhì)。在整個處理過程中必須保存酶的活性不受破壞。目前能在電鏡下定位的 酶有三大類即水解酶、氧化酶和轉(zhuǎn)移酶。酶細胞化學(xué)反應(yīng)的基本原理（一）水解酶水解酶可分為五類即磷酸酶類、酯酶類、芳香基硫酸酯酶類、糖苷酶類以及作 用于肽腱酶類。水解酶是催化水解反應(yīng)的酶類，在超微結(jié)構(gòu)水平

51、上顯示酶的細胞化 學(xué)方法都是以孵育階段為中心，孵育液中一般都有酶的反應(yīng)底物和捕捉劑。反應(yīng)的 基本原理可分兩個步驟：1、底物經(jīng)過酶的分解形成初級反應(yīng)產(chǎn)物；2、初級反應(yīng)產(chǎn) 物和相應(yīng)的捕捉劑形成一種不溶性的化合物稱為最終反應(yīng)產(chǎn)物，這些最終反應(yīng)產(chǎn)物 是一些不溶性重金屬沉淀物（如鉛、銅、鋇等），在電鏡下容易被檢出。一般來說， 這些沉淀物在細胞的位置就代表了酶促反應(yīng)的位置。（二）氧化還原酶氧化還原酶可分為氧化酶和脫氫酶兩種。在氧化酶細胞化學(xué)反應(yīng)中含有兩個既分開又緊密聯(lián)系的底物， 一個是生理底物如 氧或過氧化氫；另一個是捕捉底物，通常是四鹽酸3, 3二氨基聯(lián)苯胺（DAB ）°DAB 很容易氧化，經(jīng)

52、過一系列化學(xué)變化生成強嗜鋨性的聚合物，再經(jīng)鋨酸固定就形成鋨307黑0脫氫酶常用的捕捉劑為鐵氰化物，它在酶的作用下被還原為亞鐵氰化物，在銅 離子的存在下進一步形成高度不溶性的亞鐵氰化銅沉淀。儼黑隔電子新唯）"b"（三）酶細胞化學(xué)的常規(guī)操作流程：1固定：常規(guī)固定液選取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作為固定液，根據(jù)不同 酶的特性，也可以單獨使用其中一種作為固定液。一般固定液需要用緩沖液配置， 具體使用何種緩沖液要看具體酶的性質(zhì)而定。常用的緩沖液有醋酸緩沖液、磷酸緩 沖液、Tris緩沖液以及二甲砷酸鈉緩沖液等。2、切片：一般采用組織切片機進行切片，厚度在4060也可以用冰凍切片

53、機切片。3、4、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗 3次，每次10分鐘。孵育：孵育時必須在使用前配置新鮮孵育液。將切片放入孵育液內(nèi)，在震蕩式恒溫水浴箱中孵育，孵育溫度一般為 37r。如果沒有震蕩式恒溫水浴箱，在孵育 過程中，每5分鐘搖晃一次，使孵育液滲透均勻。孵育時間因器官和酶的種類不 同而有很大差異（具體時間見各種酶的孵育液的配方及孵育方法）。5、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗 3次，每次10分鐘，然后用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3次，每次10分鐘，所用緩沖液要保持在4C左右。6、后固定：用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液配置的1%鋨酸固定1小時。 脫水、浸透、包埋、切片同常規(guī)超薄切片制作。7

54、、電鏡觀察：超薄切片經(jīng)烘干后直接進行電鏡觀察。如果反差不好，可以進行鉛一 鈾雙重染色，但必須有不染色的切片對照。各種酶的定位、孵育液配方以及孵育條件如下:酶定位孵育液配方孵育條件酸 性 磷 酸 酶溶酶體、高爾 基復(fù)合體等0.1M P -甘油磷酸鈉5ml0.2M Tris-馬來酸緩沖液（PH5.0）10ml二甲基亞砜（DMSO）5ml0.2M硝酸鉛6ml蔗糖4.2g蒸餾水25mlPH值：5.05.2 溫度：37 r 孵育時間： 3060mi n堿 性 磷 酸 酶主要位于細胞膜0.1M P -甘油磷酸鈉5ml0.1M妥鈉緩沖液（PH9.4）20ml0.5M氯化鎂5ml0.2M氯化鈣20mlPH 值

55、:9.4 溫度：4C 孵育時間：3060mi n乙 酰 膽 堿 酯 酶神經(jīng)細胞的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核 膜、核突觸間 隙等碘化乙酰硫代膽堿5mg0.1M順丁烯二酸緩沖液（PH6.0）6.5ml0.1M枸櫞酸鈉0.5ml0.01M 硫酸銅1.5ml0.005M鐵氰化鉀1.0ml蔗糖1.0g雙蒸餾水1.0mlPH 值:6.0 溫度：4C 或室溫 孵育時間： 3060mi n葡 萄 糖6磷 酸 酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核 膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 的標(biāo)志酶G-6-P 鈉(鉀)鹽12.5mg0.2M Tris-馬來酸(PH7.6)5.0ml2%硝酸鉛1.5ml雙蒸餾水13.5mlPH 值:6.5 溫度：37 r 孵育時間： 3090mi

56、 n腺可因激活劑Mg2+-AT P 酶：PH 值:7.2苷與抑制劑不ATP鈉鹽25g溫度：37 r三三同而稍有差0.2M Tris-馬來酸(PH7.2)20.0ml孵育時間：磷異（如肌球蛋2%硝酸鉛3.0ml3060mi n酸白、細胞膜、0.1M硫酸鎂5ml酶線粒體等）蔗糖 雙蒸餾水4.0g22.0ml腺可因激活劑Na+-K+-AT P 酶：PH 值:9.0苷與抑制劑不0.2M Tris-馬來酸緩沖液(PH9.0)10.0ml溫度：37 r三三同而稍有差0.2M氯化鍶2ml孵育時間：磷異（如肌球蛋0.2M氯化鉀1ml60mi n酸白、細胞膜、0.05M氯化鎂4ml酶線粒體等）對硝基苯磷酸鈉 雙蒸餾水34g3.0ml第四