殺菌率試驗規(guī)程

1、Q/KMZJ2008液體洗滌劑殺菌試驗規(guī)程內部使用）2008年 月 日內部執(zhí)行質量管理中心實驗室1、2、3、4、5、（ 中華人民共和國衛(wèi)生部 ） （科技出版社）引用標準GB15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準QB/T2738-2005 日化產品抗菌抑菌效果的評價方法QB/T2850-2007 抗菌抑菌型洗滌劑2002 年版 消毒技術規(guī)范2001 年版 藥品微生物學檢驗手冊殺菌率試驗規(guī)程1、試驗菌、試驗溫度、作用時間、試液濃度試驗菌種：金黃色葡萄球菌（ATCC 653）8 ，大腸桿菌（ 8099 或 ATCC 2592）2 ，白色念珠菌試驗溫度： 作用時間： 試液濃度： 菌懸液用量：

2、度、取量相同2、細菌繁殖體懸液、菌片的制備程序20C± 1C。最短不得小于 30s 。常規(guī)作用時間為 中和劑鑒定用試液濃度應為正式殺菌試驗最高濃度。 正式 殺菌試驗用菌懸液的濃度、取量應與2min、5min、 1 0min、 20min。中和劑鑒定中 1 組、 2 組所用菌懸液的濃菌懸液的制備 取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吸吹數(shù)次，使菌種融化分散。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置代培養(yǎng)的菌懸液，劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37C培養(yǎng)型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于37C培養(yǎng)18h24h,即為第每隔 2-3 個月移種一次，繼續(xù)保藏。 ）。取含 取

3、第 3 代 14 代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（經 稀釋液加入斜面試管內37C培養(yǎng)18h24h。用接種環(huán)取第118h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典3代培養(yǎng)物（放在 4 C左右冰箱中保藏。18h 24h 培養(yǎng)），用吸管吸取，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用 吸管將洗液移至另一無菌 試管 中，在手掌上振敲 80 次（力度適中，勿濺出） 苔，接種在適合試驗菌生長的培養(yǎng)基中， 品微生物學檢驗手冊 211 頁）37C培養(yǎng)18h，以使細菌懸液均勻?；驈男迈r菌種斜面沾取少量菌24h （或適宜時間）。作為原菌液。（源于藥細菌繁殖體懸液應保存在4 C冰箱備用盡量減少在室溫下放置時間，以減少細菌的自然死亡。應當

4、天使用不得過夜。44回收菌數(shù)為 1X 109X 10 cfu/ml 用 PBS液配置GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準回收菌數(shù)為1 X 108 5X 108cfu/ml用TSB營養(yǎng)肉湯配置一 2002消毒技術規(guī)范、菌片的制備程序 ： 消毒技術規(guī)范 取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吸吹數(shù)次，使菌種融化分散。取含營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置代培養(yǎng)的菌懸液，劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37C培養(yǎng)型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于37C培養(yǎng)18h24h,即為第37C培養(yǎng)18h24h。用接種環(huán)取第 1 18h24h。挑取上述第 2代培養(yǎng)物中典 3 代

5、培養(yǎng)物。 取第3代14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（經18h24h培養(yǎng)），用吸管吸取TSB營養(yǎng)肉湯 加入斜面試管內，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用吸管將洗液移至另無菌試管中,在手掌上振敲 80 次,以使細菌懸液均勻,含菌量 用無菌鑷子夾住已滅菌10mmT0mm紙一角，一面朝上，注入溫箱中干燥 20min-30min ,（或在室溫自然陰干后使用）制成菌片。每個菌片回收菌落,按活菌培養(yǎng)計數(shù) 得結果，應為5X 105 5X 106 cfu/ 片。）細菌繁殖體懸液和菌片，用畢應隨時保存在 自然死亡。（應當天使用不得過夜。 ） 3、操作程序、懸液定量法殺菌試驗操作程序 樣品用無菌標準硬水稀釋至同中和劑

6、鑒定用試液濃度，或低于中和劑鑒定用試液濃度，制成（稀釋 試驗樣液。881X 10 5X 10 cfu/ml 。10ul 菌懸液，放到無菌平板內，4C冰箱內。盡量減少在室溫下放置時間，以減少細菌的、液）、將試管按需要數(shù)量分別排列于試管架上,各組由左向右,排序、標記。44配制菌懸液,濃度為 1X 10 cfu/ml、9X108 8 X10 5X10 cfu/ml、取殺菌試驗用無菌大試管，先加入5min ，用無菌吸管吸取步驟GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準或2002 消毒技術規(guī)范試驗用菌懸液，再加入有機干擾物質，混勻，置 20± 1C1 中的試驗樣液 注入其中，或吸取試驗

7、用菌懸液 ，加入到含80 次）。 - 見 QB/T 2738-2005手掌上振搖 80 次）。- 見消毒技術規(guī)范 開啟計時器，并迅速混勻（在手掌上振搖作用2min、5min、10min、20min,即刻用無菌吸管吸取 移入鑒定合格的、37C立即開啟計時器， 并迅速混勻（在5ml 樣液的試管中，立 即中（中和劑的中和劑溶液10min 后,取樣液、 10 倍- 見消毒技術規(guī)范 ）（見圖四）,置于15ml 作濃度與容量應與鑒定試驗結果規(guī)定的相同）充分混勻， 系列稀釋液 （見 GB15979-200）2 或分別吸取 2個滅菌平皿，用涼至4045C營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）傾注，轉動平皿，

8、 使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉平板，25C± 2 C培養(yǎng)72h,作活菌菌落計數(shù)。中和作用ml35C± 2 C培養(yǎng)48h （細菌）或（酵母菌）、同時用稀釋液代替樣液進行平行試驗，作為陽性對照管。陰性對照組：分別吸取試驗用相關溶液和培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察有無污染。 計數(shù)菌落時，個稀釋度 3 個平板生長菌落數(shù)全部合乎上述標準，則以該 合乎上述標準，則以該合格的 2試驗重復 3 次，求其平均值。、般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在 15cfu 300cfu 的平板為準，每3 個平板的菌落平均值作為結果；若有 2 個符合 個平板菌落的平均值作為結果。各組活菌濃度換算為對數(shù)值（

9、 N）載體法殺菌試驗操作程序根據(jù)各組活菌濃度（ cfu/ml ），計算殺菌率，見計算公式 1?；蚋鶕?jù) ，計算殺滅對數(shù)值，見計算公式2。2、即刻混勻，并按規(guī)定時間吸取樣液進行隨后的培養(yǎng)檢測；、吸取樣液 放入滅菌平皿，另吸取 菌片一角放入試樣皿和陽性對照皿。PBS 注入平皿中、作用至設定時間后，即刻用無菌鑷子夾住菌片一角，投入含 容量應與鑒定試驗結果規(guī)定的相同）充分混勻計時。（見圖四），置于兩個滅菌平皿，接種涼至 40 15ml ，轉動平皿 10-20 下，使其充分均勻，凝固中和劑的試管中（中和劑的濃度見圖三 ）中和 10min 后，取樣液或 10 倍系列稀釋液 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵

10、母菌） 于35C± 2 C培養(yǎng)48h （細菌）或72h （酵母菌），作活菌菌落計數(shù)。、試驗重復 3次，求其平均值。、陰性對照組：分別吸取試驗用相關溶液和培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察有無污染。、45C后，、試驗樣品用無菌標準硬水（過濾除菌）稀釋至規(guī)定濃度，制成（稀釋液）試驗樣液。 作為陽性對照皿。每皿用無菌鑷子 夾住A、B、空白平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌）或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）15ml 培養(yǎng)。、計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu300cfu的平板為準，每 個稀釋度 3 個平板生長菌落數(shù)全部合乎上述標準，則以該 3 個平板的菌落平均值作為結果；若有 乎上

11、述標準，則以該合格的 2 個平板菌落的平均值作為結果4、計算公式C、15cfu2 個符 合合PBC液（L磷酸鹽緩沖液）、無菌標準硬水 1ml 置于滅菌平皿內、1 殺菌率 X1 =( A - B) / AX 100%式中:殺菌率（% ;A- 對照樣品平均菌落數(shù)；B- 被試樣品平均菌落數(shù)。2、殺滅對數(shù)值（KL ）=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（ Nc）-試驗組活菌濃度的對數(shù)值（ 備注：計算殺滅對數(shù)值時，取小數(shù)點后兩位值，可以進行數(shù)字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平均生產菌落數(shù)，小于等于 1 時，即大于等于試驗前對照組平均活菌濃度的對數(shù) 值。 5 、評價標準殺菌率 90%,產品有殺菌作用。懸液定量殺滅

12、試驗中，各次的殺滅對數(shù) 值，可判定為消毒合格。1、6、 操作要點：（消毒技術規(guī)范 2002 版） 對接觸消毒劑（殺菌劑）的樣本，在達到規(guī)定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑 溶液中（中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果規(guī)定的相同）；3、 在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應按規(guī)定時間內進行，以免微生物與中和劑或中和產物 接觸過久。審核：編制：引用標準： QB/T2738-2005GB 15979-200210200210一、定義和術語中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序日化產品抗菌抑菌效果的評價方法（試驗菌懸液在一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準（試驗菌懸液在1X7 5X1071Xcfu/ml ）消毒技術規(guī)范

13、（試驗菌懸液在14 9x09 " 104cfU/ml) cfu/ml )中和劑 在微生物殺滅試驗中，試驗微生物與殺菌劑作用達到規(guī)定時間的終點時，用以中和殘留的殺菌劑，使其不在持續(xù)抑制和殺滅微生物的試劑。中和產物 成。 二、中和劑加殺菌劑 中和劑鑒定試驗原理樣品）=9 ：1，作用 10min 配置而中和劑鑒定試驗原理試驗分組試驗目的第 1 組第 2 組第 3 組第 4 組第 5 組第 6 組殺菌劑 菌液（殺菌劑 中和劑 菌液（殺菌劑 陽性菌數(shù)對照陰性對照。f培養(yǎng)菌 液 ） 中f培養(yǎng)中 和劑） f培養(yǎng)f培養(yǎng)觀察殺菌劑對觀察殘留殺菌觀察中和劑是觀察中和產陽性對照組。陰性對照組。試驗菌有無殺

14、劑被中和后，否抑菌。物，或未被完滅或抑制能力受到殺菌劑作全中和的殘留用后的試驗菌殺菌劑對試驗是否能恢復生菌的生長繁殖長。是否有影響。中和劑鑒定試驗中易出現(xiàn)的問題及解決方法解決方法出現(xiàn)的問題、組無菌生長或組平板上少于 菌降低消毒劑濃度或縮短作用時間。本）落，其它組正常。菌落數(shù)較多且數(shù)量基本相同，其它組正 常。提高消毒劑濃度或延長作用時間。組中和劑菌落數(shù)明顯少于PBS組菌數(shù)降低中和劑濃度或改變中和劑成分。組（中和產物）菌落數(shù)明顯少于 PBS!菌數(shù)， 其它組正常。提高中和劑濃度或改變中和劑成分。多次更換中和劑均不能得到滿意結果。選用載體法進行中和劑鑒定，殺菌試驗同時用載體法進行。四、鑒定試驗操作程序

15、試驗分組第 1 組第 2 組第 3 組第 4 組第 5 組第取試驗樣品 加入各取 中和取中取PBS對應組劑加入對和產物 b（稀釋液）加 入對應應組加 入對應組組20C± 1C恒菌懸液菌懸液菌懸液菌懸菌懸液溫 硬水 混液 硬水 混勻5min勻振敲 80作用至試驗預定時間，作用 10min，次，取 加入下列對應組取加入下列各對應組混勻PBS中和劑中和劑中和產物PBS振敲 80 次、/ 作用 10min/混勻取適宜稀釋度懸活菌培養(yǎng)計活菌培養(yǎng)計用中和劑 10用中和產物用稀釋液PBS液接種平數(shù)數(shù)倍系列稀釋10 倍系列10各板（ 2 個 / 樣稀釋倍系列稀釋板消毒技術規(guī)范6 組中和劑接 種平中和

16、劑懸液定量鑒定試驗操作程序中和劑鑒定評價規(guī)定中和劑鑒定合 格標準中對 1 、 2 組菌數(shù)要求。結論第 1 組不長菌或明顯少大于 5 且明于第 2組X( 1-10 )顯少于第 3 、4、> (X + 5)>Y第 3、似，誤差率w 15%三組間平均菌數(shù)=（第3+4+5組菌數(shù)）*3 ;誤差率 %=（三組平均菌數(shù) - 各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和/3 X三組間平均菌數(shù)X 100Y（ > 10）符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，中和劑與試驗樣品的中和產物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。備注a菌懸液濃度及制備： 消毒技術規(guī)范 用PBS（試驗菌懸液在 1X 1

17、07 5X 1oCfu/ml ） 混合，作用 10minb 中和產物的配置：先將試驗樣液與中和劑溶液9ml后制成本）序中和劑鑒定試驗操作程序- 載體法試驗分組第 1 組第 2 組第 3 組第 4 組第 5 組第 6用無菌鑷子取吸取試驗吸取試驗樣品吸取中和劑吸取中和產吸取 PBS組菌片加入下列樣品于無菌平于無菌物于于無菌對應組于無菌平皿內平皿內無菌平皿內平皿內皿內四、 2 鑒定試驗操作程混勻作用 10min ，立即用無菌鑷子取出菌片移入對應組作用至預定時間， 立即用無菌取原液或稀釋液 接種本）操作要點PBS中和劑中和劑中和產物稀釋液作用 10min作用 10min/用稀釋液用稀釋液 10用中和劑

18、用中和產物用稀釋液 10稀釋液+倍1010 倍系列系列稀釋倍系列稀釋10 倍系列稀倍系列稀釋中和劑稀釋釋各接種平板鑷子取出菌片移入對應組試管振打 80次即刻混勻，并按規(guī)定時間接種培養(yǎng)基平板（ 2 個 / 樣第 1 組不長菌或明第 2 組有且較第1 組為多，較第第 3、4、5 組菌數(shù)相似，評價規(guī)定顯少于第3、 4、 5 組為三組間平均菌數(shù) =（第2少的菌數(shù)生十3；組長，并符合下表要求。中和劑鑒定合0>5誤差率 %=（三組平均菌數(shù)格標準中對 1 、X（1-10 ）>（X 5）數(shù)）的絕對值之和 /3 Z2 組菌數(shù)要求。丫（ > 10）> 丫X 100中和劑鑒定評價組間平均菌數(shù)

19、符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，且其誤差率W 15% 第6組無3+4+5 組菌數(shù)）各組菌落平均中和劑與試驗樣品的中結論和產物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。a菌懸液濃度及制備：用PBS#指示菌制成 1X 1049X備注消毒技術規(guī)范用PBS （試驗菌懸液在b 中和產物的配置：先將試驗樣液 與中和劑溶液4104 cfu/ml 懸液。（ -GB15979）1 X 107 5X 107 .,.cfu/ml9ml 混合，作用） 10min 后制成四、 3 鑒定試驗操作程序中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序試驗分組第2 組取 菌懸取試驗樣品加入各液, 分別加入各對應組組振敲 8

20、0次，混勻作用至試驗預定時間，取 加入下列對應組PBS中和劑第 3 組第 4 組第 5 組第 6取中和取中取PBS組劑加入對和產物 b 加（稀釋液）加應入對應組入對應組組作用 10min，取加入下列各對應組中和劑中和產物PBSGB/T 15979作用 10min振敲 80 次、混取適宜稀釋度懸活菌培養(yǎng)計活菌培養(yǎng)計用中和劑 10用中和產物液 接種平板倍系列稀釋10 倍系列用稀釋液10PB3中和劑各 接種平稀釋倍系列稀釋第 3、似，第 1 組不長中和劑鑒定評菌或明顯少大于 5 且明誤差率w 15%價規(guī)定于第 2組顯少于第 3 、三組間平均菌數(shù)4、=（第3+4+5組菌數(shù)）* 3 ;差率 %=（三組平均菌數(shù) - 各組菌落平均數(shù)）中和劑鑒定合 格標準中對 1 、 2 組菌數(shù)要求。結論X( 1-10 )> (X + 5)>Y的絕對值之和/3 X三組間平均菌數(shù)X 100Y（ > 10）符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，中和劑與試驗樣品的中和產物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。a菌懸液濃度及制備：用PBS將指示菌制成1X 1049X 104 cfu/ml懸液。（-GB15979）備注b 中和產物的配置：先將試驗樣液與中和劑溶液9ml