酶工程第五章酶、細胞、原生質體固定化

1、n 工作原理工作原理: 利用試紙上的固定化酶利用試紙上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 與血液中的葡萄糖反應產生與血液中的葡萄糖反應產生的電流來測血糖值。的電流來測血糖值。n強生穩(wěn)豪倍易血糖儀強生穩(wěn)豪倍易血糖儀 葡萄糖氧化酶電極葡萄糖氧化酶電極 酶電極示意圖酶電極示意圖 -D-葡萄糖葡萄糖O2 D-葡萄糖酸葡萄糖酸-1, 5-內酯內酯H2O2半透膜半透膜酶膠層酶膠層感應電極感應電極第六章第六章 酶、細胞、原生質體固定化酶、細胞、原生質體固定化1. 酶（酶（Enzyme）nOrganic chemical substance (a catal

2、yst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself.n活細胞產生的，能在細胞內外起活細胞產生的，能在細胞內外起催化作用催化作用的生的生理活性物質理活性物質。知識點回顧知識點回顧酶酶單純酶單純酶結合酶結合酶（全酶）（全酶）= = 酶蛋白酶蛋白 + + 輔因子輔因子輔酶輔酶輔基輔基酶的催化專一性主要決定于酶的催化專一性主要決定于酶蛋白酶蛋白部分。部分。輔因子輔因子通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。2. 酶

3、的組成酶的組成p 必需基團必需基團：這些基團若經化學修飾使其改變，這些基團若經化學修飾使其改變，則酶的活性喪失。則酶的活性喪失。p 活性中心活性中心：酶分子中直接與底物結合，并和酶酶分子中直接與底物結合，并和酶催化作用直接相關的部位。催化作用直接相關的部位。必需基團必需基團活性中心活性中心活性中心外活性中心外結合基團結合基團催化基團催化基團專一性專一性催化性質催化性質3. 酶的活性中心（酶的活性中心（active center）u優(yōu)點：優(yōu)點： 催化效率高催化效率高 專一性強專一性強 反應條件溫和反應條件溫和 催化活性受到調節(jié)和控制催化活性受到調節(jié)和控制4. 酶的特性酶的特性u缺點：缺點： 溶液

4、酶很不穩(wěn)定溶液酶很不穩(wěn)定 增加分離的難度和費用增加分離的難度和費用 影響產品質量影響產品質量 回收困難，一次性使用回收困難，一次性使用固定化技術固定化技術固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme）有效改善方法之一有效改善方法之一n思路思路：設計一種方法，將酶束縛于特殊的相中，：設計一種方法，將酶束縛于特殊的相中，使它與整體分開但仍能進行底物和效應物的分使它與整體分開但仍能進行底物和效應物的分子交換。子交換。n效果效果：固定化的酶可像一般化學反應中的：固定化的酶可像一般化學反應中的固體固體催化劑催化劑一樣，既有酶催化特性，又有一般化學一樣，既有酶催化特性，又有一般化學催化劑可回收

5、、反復使用等優(yōu)點，并可使生產催化劑可回收、反復使用等優(yōu)點，并可使生產工藝連續(xù)化、自動化。工藝連續(xù)化、自動化。 酶工程原理和基本過程酶工程原理和基本過程 菌種菌種擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵酶液發(fā)酵酶液酶的提取酶的提取 酶成品酶成品 原料原料 前處理前處理 殺菌殺菌 酶反應器酶反應器 反應液反應液 產品提取產品提取 產品產品酶的固定化酶的固定化固定化酶發(fā)展歷史固定化酶發(fā)展歷史n1916年，年，Nelson和和Griffin發(fā)現(xiàn)酶的固定化現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)酶的固定化現(xiàn)象（蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。（蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。 n20世紀世紀50年代，年代，Grubhofer和和Schleit

6、h采用聚氨基采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，分別制成固定化的胃蛋白酶、苯乙烯樹脂為載體，分別制成固定化的胃蛋白酶、淀粉酶等。淀粉酶等。n1969年，千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨年，千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；笍幕旌习被嶂猩a基酰化酶從混合氨基酸中生產L-氨基酸。氨基酸。 n1971年，第一屆國際酶工程會議在美國召開，會年，第一屆國際酶工程會議在美國召開，會議的主題是議的主題是固定化酶（固定化酶（immobilized enzyme） 。 n我國：我國：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。年（中科院微生物所、上海生化所）。固定化酶發(fā)展歷史固定化酶發(fā)展歷史n1973年，日本

7、首次在工業(yè)上應用固定化大腸桿菌年，日本首次在工業(yè)上應用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶生產菌體中的天冬氨酸酶生產L-天冬氨酸。天冬氨酸。n20世紀世紀70年代后期：年代后期：固定化細胞技術固定化細胞技術n1982年，日本首次用年，日本首次用固定化原生質體固定化原生質體生產谷氨酸生產谷氨酸n近年來，隨著近年來，隨著納米材料納米材料和和磁性材料磁性材料等新材料的出等新材料的出現(xiàn)，使固定化酶又成為研究熱點，目前酶的固定現(xiàn)，使固定化酶又成為研究熱點，目前酶的固定化方法已超過化方法已超過200種。種。本章主要內容本章主要內容n第一節(jié)第一節(jié) 酶固定化酶固定化n第二節(jié)第二節(jié) 細胞固定化細胞固定化n第三節(jié)第三

8、節(jié) 原生質體固定化原生質體固定化第一節(jié)第一節(jié) 酶的固定化酶的固定化水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）水不溶性酶（固定化酶）固定化技術固定化技術早期：早期： 水不溶酶（水不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（固相酶（solid phase enzyme）優(yōu)點優(yōu)點（1）提高酶穩(wěn)定性）提高酶穩(wěn)定性（2）可反復或連續(xù)使用；易于和反應產）可反復或連續(xù)使用；易于和反應產物分開；酶的使用效率提高，成本降低物分開；酶的使用效率提高，成本降低（3）酶反應過程可嚴格控制）酶反應過程可嚴格控制（4）產物溶液無酶殘留，簡化提純工藝；）產物溶液無酶殘留，簡化提純工藝

9、；增加產物收率，提高產物質量增加產物收率，提高產物質量（5）較游離酶更適合多酶反應）較游離酶更適合多酶反應缺點缺點（1）固定化時酶活有損失）固定化時酶活有損失（2）增加了生產初始成本）增加了生產初始成本（3）只能用于可溶底物且較小分子）只能用于可溶底物且較小分子（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應）與完整菌體相比不適宜于多酶反應2.固定化酶的特點固定化酶的特點載體結合法載體結合法交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法物理吸附物理吸附共價結合共價結合離子結合離子結合酶的固定化酶的固定化脂質體脂質體凝膠型凝膠型微囊型微囊型熱處理法熱處理法載體結合法載體結合法（1）物理吸附法）物理吸附法a. 無機吸附劑：無機吸附

10、劑：硅藻土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥硅藻土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥基磷灰石、活性炭等。無機吸附劑的吸附容量基磷灰石、活性炭等。無機吸附劑的吸附容量一般一般很低很低，多在，多在1mg蛋白蛋白/g吸附劑。吸附劑。b. 有機吸附劑：有機吸附劑：纖維素、膠原、火棉膠等。有機吸附劑的吸附容量纖維素、膠原、火棉膠等。有機吸附劑的吸附容量一般較高一般較高，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶等，吸附容量為酯酶等，吸附容量為70mg蛋白蛋白/cm2膜。膜。物理吸附法固定化酶舉例物理吸附法固定化酶舉例載體載體固定化酶固定化酶活性炭活性炭-淀粉酶、淀

11、粉酶、-淀粉酶淀粉酶蔗糖轉化酶、葡萄糖淀粉酶蔗糖轉化酶、葡萄糖淀粉酶多孔玻璃多孔玻璃核糖核酸酶、木瓜蛋白酶核糖核酸酶、木瓜蛋白酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶脂肪酶、葡萄糖氧化酶氧化鋁氧化鋁葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶碳酸鈣凝膠碳酸鈣凝膠亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶纖維素纖維素胰蛋白酶、核糖核酸酶胰蛋白酶、核糖核酸酶麩素麩素-淀粉液化酶淀粉液化酶硅膠硅膠磷酸化酶磷酸化酶載體載體 (2) 離子結合法離子結合法酶酶如何解決解吸附問題如何解決解吸附問題 通過通過酶蛋白化學修飾酶蛋白化學修飾來增加酶分子上來增加酶分子上電荷電荷，能有效克，能有效克服解吸附問題服解吸附問題。 例：用水溶性例：用水溶性乙烯乙烯-順丁烯二酸酐

12、順丁烯二酸酐共聚物共價修飾的胰蛋白共聚物共價修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE-纖維素纖維素和和DEAE-Sephadex載載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。 酶的吸附與解吸還與介質中酶的吸附與解吸還與介質中離子強度、離子強度、pH、溫度、溫度、蛋白質濃度蛋白質濃度及及酶和載體的特性酶和載體的特性相關。相關。 例：例：pH的變化的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶的吸附。在等電點兩側的吸附。在等電點兩側(1-2pH單位單位)吸附將明顯減少。吸附將明顯減少。 載體的

13、表面積、多孔性及其預處理載體的表面積、多孔性及其預處理都影響對酶的吸附。都影響對酶的吸附。 (3) 共價結合法共價結合法 酶蛋白酶蛋白N-端的氨基或端的氨基或Lys殘基的殘基的-氨基。氨基。 酶蛋白酶蛋白C-端的羧基、端的羧基、Asp殘基的殘基的-羧基和羧基和Glu殘殘基基-羧基。羧基。 Cys殘基的巰基。殘基的巰基。 Ser、 Thr 、 Tyr殘基的羥基。殘基的羥基。 Phe和和Tyr殘基的苯環(huán)。殘基的苯環(huán)。 His殘基的咪唑基。殘基的咪唑基。 Trp殘基的吲哚基。殘基的吲哚基。 Arg殘基的胍基。殘基的胍基。n 被偶聯(lián)的基團應是酶活性的被偶聯(lián)的基團應是酶活性的非必需基團非必需基團，否則將

14、，否則將導致酶失去活性。導致酶失去活性。纖維素纖維素瓊脂糖膠瓊脂糖膠葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠甲殼質氨基酸共聚物甲殼質氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物甲基丙烯醇共聚物常常用用載載體體芳香氨基芳香氨基羥基羥基羥甲基羥甲基氨基氨基載載體體上上的的功功能能基基團團酶酶分分子子上上的的非非必必需需側側鏈鏈基基團團氨基氨基胍基胍基羧基羧基巰基巰基咪唑基咪唑基羥基羥基二者如何反應？二者如何反應？載體活化方法載體活化方法1. 重氮法重氮法2. 疊氮法疊氮法3. 溴化氰法溴化氰法4. 烷基化法烷基化法 reaction ? ? ? ? ? 選擇適宜的固定化方法與相應的載體。選擇適宜的固定化方法與相應的載體。 嚴格控制反

15、應條件，提高反應的專一性。嚴格控制反應條件，提高反應的專一性。 應用應用可逆抑制劑可逆抑制劑或或底物底物，封閉或牽制酶的活性中，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構型和相應心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構型和相應基團?；鶊F。如：在進行腺苷三磷酸酶如：在進行腺苷三磷酸酶(ATPase)固定化時，可先固定化時，可先用對羥基汞苯甲酸用對羥基汞苯甲酸(PHMB) 保護巰基，然后通過疊保護巰基，然后通過疊氮反應將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，完成固定化后，氮反應將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，完成固定化后，再用還原劑使再用還原劑使-SH活化，可得到高活性的固定化酶?；罨?，可得到高活性的固定化

16、酶。酶酶交聯(lián)法交聯(lián)法n 借助借助雙功能試劑雙功能試劑使酶分使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網狀結構的固定化酶成網狀結構的固定化酶n 特點：特點：共價鍵、不使用共價鍵、不使用載體。載體。n 雙功能試劑：雙功能試劑：戊二醛、戊二醛、己二胺等。己二胺等。雙功能試劑雙功能試劑n 第一篇報道第一篇報道：戊二醛交聯(lián)羧肽酶，得到一種：戊二醛交聯(lián)羧肽酶，得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶分子間交聯(lián)的固定化酶酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交

17、聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶共同點：均利用共同點：均利用共價鍵共價鍵結合結合不同之處：交聯(lián)法不同之處：交聯(lián)法不使用載體不使用載體酶酶優(yōu)點優(yōu)點: 結合牢固，可以長時間使用結合牢固，可以長時間使用缺點缺點 因交聯(lián)反應激烈，酶分子多個基團被交聯(lián)，因交聯(lián)反應激烈，酶分子多個基團被交聯(lián)，酶活損失大；酶活損失大； 顆粒較小，使用不便顆粒較小，使用不便如何解決？如何解決？u 向酶溶液中加入輔助蛋白的交聯(lián)過程，向酶溶液中加入輔助蛋白的交聯(lián)過程，酶活酶活回收率回收率和和機械強度機械強度較交聯(lián)酶法較交

18、聯(lián)酶法高高。u 用雙功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)：用雙功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)：酶在交聯(lián)反應過程中因化學修飾而引起失活，酶在交聯(lián)反應過程中因化學修飾而引起失活，或因得到的酶量有限時，以一些或因得到的酶量有限時，以一些輔助蛋白，如輔助蛋白，如牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等與酶一起與酶一起進行交聯(lián)。進行交聯(lián)。解決方法解決方法2：降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應時間降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應時間解決方法解決方法1：酶與輔助蛋白交聯(lián)酶與輔助蛋白交聯(lián)先使用明膠（蛋白質）先使用明膠（蛋白質）包埋后包埋后，再用戊二醛，再用戊二醛交聯(lián)交聯(lián)；先用尼龍（聚酰胺類）膜或活性炭、先用尼龍（

19、聚酰胺類）膜或活性炭、Fe2O3等等吸附吸附后，再后，再交聯(lián)交聯(lián)。解決方法解決方法3：與吸附法或包埋法聯(lián)合使用與吸附法或包埋法聯(lián)合使用熱處理法熱處理法將含酶細胞在一定溫度下將含酶細胞在一定溫度下加熱處理加熱處理一段時間，一段時間，使酶固定在菌體內而制備得到固定化菌體使酶固定在菌體內而制備得到固定化菌體（死細胞）（死細胞）適用：適用：熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好的酶的酶雙重固定化：與交聯(lián)法或其他固定化方法聯(lián)雙重固定化：與交聯(lián)法或其他固定化方法聯(lián)用用原理：原理：將聚合物單體與酶溶液混合，再借助將聚合物單體與酶溶液混合，再借助于于聚合促進劑聚合促進劑(包括交聯(lián)劑包括交聯(lián)劑)的作用進行聚合，的作用進行聚合，酶

20、被包埋在聚合物中以達到固定化。酶被包埋在聚合物中以達到固定化。類型：類型：主要有主要有凝膠包埋凝膠包埋、半透膜包埋半透膜包埋、脂質脂質體包埋體包埋。包埋法包埋法 1. 凝膠包埋凝膠包埋 (gel entrapment) 常用凝膠常用凝膠天然膠：天然膠：瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠合成膠：合成膠：聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂 制備方法制備方法u 以天然膠為載體（強度差）：以天然膠為載體（強度差）：先將天然物溶于含水介質，然后再與酶液混和，先將天然物溶于含水介質，然后再與酶液混和，最后使之膠化，制成膠包埋的固定化酶。最后使之膠化，制成膠包

21、埋的固定化酶。 如：如：膠原可以添加丁醇；角叉菜膠可以添加膠原可以添加丁醇；角叉菜膠可以添加KCl，然后冷卻；海藻酸可添加然后冷卻；海藻酸可添加CaCl2，使之以膠的形，使之以膠的形式沉淀下來。式沉淀下來。 u 以合成膠為載體（易失活）：以合成膠為載體（易失活）：先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質中，然后先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質中，然后加入加入N,N-甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的聚丙烯酰胺凝膠中。成的聚丙烯酰胺凝膠中。海藻酸鈉包埋胰蛋白酶步驟海藻酸鈉包埋胰蛋白酶步驟l 凝膠孔徑應小于酶分子直徑，因而不適用于凝膠孔徑應小于酶分子直徑，因而不適用于大大

22、分子底物或大分子產物分子底物或大分子產物的酶類的固定化的酶類的固定化u 將酶包埋于具有將酶包埋于具有半透性半透性聚合物膜聚合物膜的的微囊內微囊內。u它使酶存在于類似細胞內它使酶存在于類似細胞內的環(huán)境中，可以防止酶的的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。同時，穩(wěn)定性。同時，小分子底小分子底物物能通過膜與酶作用，能通過膜與酶作用，小小分子產物分子產物經擴散而輸出。經擴散而輸出。 2. 半透膜包埋法半透膜包埋法 (microencapsulation)l 乳化分散：乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，取含有酶和親水性

23、單體的水溶液，在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。l 表面聚合：表面聚合：將含有疏水性單體的有機溶媒加入將含有疏水性單體的有機溶媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應，生成的薄膜把到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。酶包圍起來形成微型膠囊球。1 1l 清洗：清洗：反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的剩余單體。剩余單體。 微囊微囊酶液滴酶液滴例：尼龍膜界面聚合包埋例：尼龍膜界面聚合包埋酶酶+己二胺己二胺(水水) +庚二酰氯庚二酰氯 (氯仿氯仿) 混合混合 乳化，二種單體乳化，二種單體(己二胺和庚二酰氯己二胺和

24、庚二酰氯) 在水相、有機相交界處聚合在水相、有機相交界處聚合 形成包埋酶的尼龍膜珠粒形成包埋酶的尼龍膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶破乳化，得到微囊包埋酶u原理：原理：在酶的水溶液中添加在酶的水溶液中添加表面活性劑表面活性劑，使，使之乳化形成液膜達到包埋的目的。之乳化形成液膜達到包埋的目的。u表面活性劑表面活性劑(surfactant)：具有固定的親水親：具有固定的親水親油基團，在溶液的表面能定向排列，并能使油基團，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質。表面張力顯著下降的物質。u該法不含化學反應，簡便，而且固定化是該法不含化學反應，簡便，而且固定化是可可逆逆的，但

25、有滲漏的可能性。的，但有滲漏的可能性。表面活性劑乳化液膜法表面活性劑乳化液膜法：缺點：缺點：反應條件要求高，制備成本也較高。反應條件要求高，制備成本也較高。 微囊直徑幾微米幾百微米，比表面積大，微囊直徑幾微米幾百微米，比表面積大，物質交換迅速物質交換迅速低分子底物低分子底物可以自由通過可以自由通過并進入微囊并進入微囊內，與內，與酶反應后的酶反應后的生成物被排除在微囊外生成物被排除在微囊外酶酶本身是高分子物質不能通過微囊而本身是高分子物質不能通過微囊而被留在被留在微囊中微囊中外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質也外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質也無無法進入微囊內法進入微囊內優(yōu)點優(yōu)點:u 將酶包埋

26、于將酶包埋于脂質體脂質體(Liposome)中中u 脂質體：具有脂質體：具有脂雙層結構脂雙層結構和和一定包囊空間一定包囊空間的的微球體微球體。u 特點：特點： 具有一定的機械性能，能定向將酶等被包具有一定的機械性能，能定向將酶等被包裹物攜帶到體內特定部位，然后將被包裹物質裹物攜帶到體內特定部位，然后將被包裹物質釋放。因此，其在釋放。因此，其在藥物應用方面藥物應用方面受到重視。受到重視。3. 脂質體（脂質體（Liposome）包埋法）包埋法 包埋法包埋法是目前是目前應用最多應用最多的一種較理想的方法，的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：與其它固定化方法相比：優(yōu)點優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反

27、應，很少改：不與酶蛋白氨基酸殘基反應，很少改變酶的高級結構，變酶的高級結構，酶活回收率高酶活回收率高。缺點缺點：只適合作用于：只適合作用于小分子底物和產物小分子底物和產物的酶。的酶。用用微膠囊微膠囊各種固定化方法的優(yōu)缺點比較各種固定化方法的優(yōu)缺點比較二、固定化酶的性質二、固定化酶的性質 l 影響酶催化活性的因素：影響酶催化活性的因素： 1. 構象改變和立體屏蔽構象改變和立體屏蔽 2. 分配效應和擴散限制效應分配效應和擴散限制效應（1）酶的活力）酶的活力n一般一般下降下降n解決辦法：考慮相應的固定化過程可能對酶的影解決辦法：考慮相應的固定化過程可能對酶的影響，避免損害酶的活性中心，有時在固定化反

28、應響，避免損害酶的活性中心，有時在固定化反應體系中會加入體系中會加入抑制劑、底物或產物抑制劑、底物或產物以保護酶的活以保護酶的活性中心。性中心。n例：乳糖酶的固定化就采用在其例：乳糖酶的固定化就采用在其抑制劑抑制劑葡萄糖葡萄糖- -內酯存在下進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可內酯存在下進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可獲得高活力的固定化乳糖酶。獲得高活力的固定化乳糖酶。（2）酶的穩(wěn)定性）酶的穩(wěn)定性n一般一般提高提高n原因：原因：固定化增加了酶固定化增加了酶活性構象活性構象的牢固程度，的牢固程度， 可防可防止酶分子伸展變形。止酶分子伸展變形。抑制酶的抑制酶的自身降解自身降解。固定化部分阻擋了固定化部

29、分阻擋了外界不利因素外界不利因素對酶的侵襲。對酶的侵襲。p對熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度對熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度A固定化酶固定化酶B游離酶游離酶如：氨基酰化酶，如：氨基?；?，70，15分鐘，酶失去活性。分鐘，酶失去活性。而固定化后，而固定化后， 70，15分鐘，有分鐘，有80%活性?；钚?。p對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性增強對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性增強p對變性劑作用的穩(wěn)定性提高對變性劑作用的穩(wěn)定性提高p保藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高保藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高u 天然胰凝乳蛋白酶在天然胰凝乳蛋白酶在pH 4.1，4保存保存4個月，個月，殘留活力僅為原活力的殘留活力僅為原活力的2%。偶聯(lián)于瓊

30、脂糖后，在。偶聯(lián)于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存同樣條件下，卻可保存82%的活力，有利于運輸、的活力，有利于運輸、貯存和重復使用。貯存和重復使用。（3）酶的最適溫度）酶的最適溫度u 最適溫度與酶穩(wěn)定性有關：多數(shù)酶固定化后熱最適溫度與酶穩(wěn)定性有關：多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升上升（有例外）。（有例外）。u 例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高510；以共價結合法固定化的色氨酸酶，其最適溫度比以共價結合法固定化的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高游離酶高

31、515。u 同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其其最適溫度可能不同最適溫度可能不同。u 如：如：氨基?；赴被；赣糜肈EAE葡聚糖凝膠經離子鍵結合法固定化后，葡聚糖凝膠經離子鍵結合法固定化后，其最適溫度其最適溫度(72)比游離酶的最適溫度比游離酶的最適溫度(60)提高提高12；用用DEAE纖維素固定化，其最適溫度纖維素固定化，其最適溫度(67)比游比游離酶提高離酶提高7；用烷基化法固定化的氨基?；?，其最適溫度卻用烷基化法固定化的氨基?；?，其最適溫度卻比游離酶則有所降低。比游離酶則有所降低。（4）酶的最適）酶的最適pH值值u 酶固定化后，對底物酶固定化后，對底物 作用的最適作用的最適pH和酶和酶 pH曲線常發(fā)生偏移曲線常發(fā)生偏移u原因：原