膜蛋白的提取與分離

1、膜蛋白的分離、簡介：1細胞質(zhì)膜資料 1895年Qverton從研究細胞透性得出"細胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成1925年 Gorter&Grendel: 用脂單分子膜技術(shù)測定細胞膜中脂分子的總 面積，提出： "細胞膜是由雙層脂分子組成 "。1935年 Danielli&Davson ：從測定膜的表面張力得出細胞膜的 "三明治結(jié)構(gòu)模型 "，即蛋白質(zhì)脂 -蛋白質(zhì)。1959年Roberts。n:用電鏡觀察生物膜提出"單位膜模型"，將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機構(gòu)統(tǒng)一起來 厚度： 2(暗)+( 亮)+2 (暗) 細胞質(zhì)膜的主要功

2、能概括如下：(1) 為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境(2) 選擇性的物質(zhì)運輸，包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；(3) 提供細胞識別位點，并完成細胞內(nèi)外信息跨膜傳遞；(4) 為多種酶提供結(jié)合位點，使酶促反應(yīng)高效而有序地進行；(5) 介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的連接質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細胞表面特化結(jié)構(gòu)。2膜蛋白雖動物細胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù) 目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學(xué)功能。根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大 類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。(1)外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵

3、與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度 就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。(2)內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜解后才可分離出來。獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對我們顯得非常的重要。1. J”O(jiān)lyvopnriiw氣丿7,I r 七eytaUAtaton附注：使用分級抽提方法獲得的 膜蛋白”中只有很少一部分是具備多 跨膜區(qū)的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，仍然是蛋白組學(xué)的一個瓶頸，不管采用2-D技術(shù)也好，ICAT乃至Proein microarray都 還不能有效解決這一問題。二、蛋白抽提 三、談及蛋白分離，我們想

4、到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過 濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分 溶、酶解法有時這些方法常常組合到一起對特定的物質(zhì)進行分離 純化。由于蛋白質(zhì)種類繁多，不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異， 其溶解度也各不相同 .根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性， 同時可選擇不同的溶劑 提取，分為水溶液提取和有機溶劑提取 .四、但是針對膜蛋白的提取與細胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于 它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉 胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化 的重要步驟是選擇適當?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，CHA PS一種離子去污劑）

5、，Emulgen和Lubrol等表面活性劑。五、1、分離膜蛋白的方法（原則性） ：六、1）先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃 度離心得到含有膜蛋白的粗組分。 （例如： michael11 液氮研磨組織， 加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。收 集37% 與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 七、2）用特殊的去污劑選擇性的分離。從膜上提取蛋白有許多困難 在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來， 然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定 .去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對所需要蛋白質(zhì)的提取效

6、率來確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟 .雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進行純化，但最終仍可能需要除 去去垢劑 .這常常會引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測序的，他將不是一個問題 . 如果不是用于測序的， 可考慮使用能夠黏附去垢劑的 疏水珠.許多文獻和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中， 都介紹有許多種不 同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑 .然而，他們并不是普遍適用的 . 在設(shè)計膜蛋白溶解方案時，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如 triton X-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測試與280nm處的吸收有關(guān)，就 應(yīng)避免使用這類去垢劑 .八、將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細胞核分離后，

7、再進一步從細胞膜制劑中 將所需的膜蛋白增溶下來 .這種做法的好處是可以用強烈的去垢劑提取細胞骨架的相關(guān)蛋白，而無需考慮胞質(zhì)蛋白、細胞核成分或染色質(zhì) 成分的混入 .使用這種方法所獲得的膜蛋白，無論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白( <5000Da )要多.一般提取的膜蛋白 量往往只占膜蛋白總量的不足 % ，所以充分的膜蛋白的提取，無疑對 于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的 .第二種方法簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。一般的都是利用 4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，在溫度超過20度時，此溶液分為水相和去污相;此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去

8、污劑相中。利用此性 質(zhì)可提取膜蛋白。九、3 )膜蛋白色譜 (Chromatography of MembraneProtei n,CMP）CMP+分離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰 石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（ P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大 小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究 CAMP的分離機制發(fā)現(xiàn),樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在 SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。十、層析柱提?。▍⒉襟E）十二、

9、4）順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。用 Tris 堿溶液裂解細胞提取高溶 解性蛋白；把未溶解的 pellet 用標準液溶解提取高疏水性蛋白；最后 用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前兩次抽提后 不能溶解的膜蛋白。十三、 5)Centrifugal protein extraCtion .離心的CeltsTns extract!or10min vertex, 40 interval sonificatfoncentrifugepelletcytosolUreafThk)urea extractiOfilOmin vortex, 4

10、0 intervals sonrficalioncentrifugeI0fnmj2,000g, 25*CpeHetmembrane fractioni原理：高滲的蛋白裂解液讓細胞溶漲破裂后，超高速離心 評價：盡管分級（胞漿和胞膜）之間有清洗的步驟，但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點.該方法相較MOLLOY MP教授在1998年electro phoresis上發(fā)表的分級抽提法減去了第rH 步（用tris抽提水溶性蛋白）和最后一步（極難溶蛋白）,在操作上也作了簡化，總而言之 是一種不錯的方法。（codegreen）6）detergent- based :提取時先裂解液裂胞膜（選用

11、不同的去污試劑是 關(guān)鍵），梯度離心分離細胞器（ER），然后分級抽提方法。例如，去掉 細胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是 裂胞膜時不溶的部分。總的感受：細胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量 測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便 迅速。到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學(xué)的一個瓶頸。2、分離膜蛋白的方法（操作）1）分離細胞膜蛋白的方法： 1冰上刮下細胞后將細胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 A中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融 2次。2 5000轉(zhuǎn)4度離心，驅(qū)除核及未裂解的細胞。3取

12、上清12000轉(zhuǎn)4度離心 10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。4 12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 C中提取后測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，分裝后-20度保存?zhèn)溆谩uffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,mlLeupeptin,20uM pmsf(PH= buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,mlLeupeptin,20uM pmsf(PH= 1mM EGTA buffer C : ml Leupeptin,20

13、uM pmsf,50mMTris-cl(PH=,1、細胞放在冰上，去除上清，用 pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次2、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min 3、刮下單層細胞， 4度下10 000g 5min 離心4、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 OOOg離心5min5、收集水相留作分析 6、用 5OOul 冰冷的 buffer C 溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min 后加溫， 在按步驟 6再次離心 7、按步驟8再次抽提去污劑相，用 buffer C 將洗滌后的去污劑相稀釋 到初始體積8、用等量的 buffer A 分別稀釋水相與去污相，并進

14、行免疫沉淀實驗 試劑：1、2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （pH7。 5）、蛋白酶抑制劑2、緩沖液 A （含0。5mol/LNaCI 的 RIPA buffer）3、buffer C 10mmol/L Tris HCl 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA3）分離細胞膜蛋白的方法：7M urea 2M thiourea 4%chaps %sb3-10 1000000個細胞，可用此 buffer 1ml 。冰浴勻漿。冰上置 30分鐘。4度高速低溫離心 30min 。取上清-20保存。4）分離組織膜蛋白的方法： 1 、取

15、組織，加入 10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。2、J6-HC離心機800rpm , 4C離心10min后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。3、lOOOOOg , 4C離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B重懸,冰上孵育2hr后分裝至EP管，Eppendorf臺式離心機lOOOOrpm，4 °C離心 30min 。4、收集所得上清液即為膜組份。Buffer A :蔗糖，5mM Tris-HCl (PH ) , 120mM KCl, 1mM EDTA,1mMEDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/mlA

16、protinin 。冰上預(yù)冷。Buffer B: 20mM HEPES(PH )， 10%甘油， 2% Triton X-100, 1mMEDTA, 1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上預(yù)冷。5）分離組織膜蛋白的方法：RIPA 1XPBS 1%NP40去氧膽酸鈉%SDS以下用時加入10mg/ml PMSF 異丙醇（終濃度 10ul/ml ）Aprotinin (30ul/ml )1000mM Sodium Orthovandate ( 10ul/ml )冰凍組織 100mg/ 細胞1

17、000000個，可用 RIPA buffer 1ml 。冰浴勻漿。冰上置 30分鐘。4度高速離心 30min ，20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。取上清-20保存。6）分離細菌膜蛋白的方法：于20ml營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)細菌，37C, 200rpm。 lOOOOg、20min、4C離心，去上清。 20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg 緩沖液。 超聲波破碎細菌。 3000g, lOmin、室溫下離心去除未破碎細菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細菌外被成分）。 超速離心1: 1OO,OOOg，60min , 4 C,去除上清（胞質(zhì)成分），收集細菌外被成分。 用1

18、0ml含2%的SLS的Tris-Mg緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育2O-3Omin 。 超速離心II : 70,000g , 60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細胞質(zhì)膜）。重復(fù)、兩步。 充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用ml的ddH20重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度（mg/ml）=D260測定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70 C貯存。試劑 Tris-Mg緩沖液10mM Tris-Cl 5mM MgCl2 pH , 4 C保存2%（w/v）十二烷基肌氨酸鈉（SLS）7) 來源于 Methods Enzymology (1974)1. 取一定量酶處理的細胞，用

19、勻漿器破碎，操作要溫和，使細胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強度和滲透壓，以每克細胞濕重加 40ml 介質(zhì)。2. 用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙一 g,min上下勻漿4 6次，每次 5S。3. 過濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入50 "介 質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上 次勻漿的上清液。4. 合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100山介質(zhì)，離心 10min ，棄上清，留沉淀。5. 將沉淀部分加入 70%蔗糖15份，然后分別置于

20、三個離心管中，上面依次疊加54% 、49%、45% ， 41%， 37%蔗糖溶液各 2、2、5、5、 3份。6. 700kg離心90min，分離介質(zhì)在之間形成介面。7. 收集d為ml之間的細胞膜，力口 30倍的介質(zhì)以離心10min，洗滌2次。8. 保存于 L Tris-HCl 緩沖液中，用于細胞膜的研究分析8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法： （所有操作都在 4攝氏度下進行）1. 在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述操作，直至組織碎成 1mm3大小的碎片，且無可見的血。2. 加入5倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃勻漿器中，抽研 10-20次，勻漿組織。3. 勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細胞膜、線粒體和細胞溶膠。沉淀中有未破碎的細胞及細胞核。棄沉淀。4. 上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。5. 上清4攝氏度lOOOOg離心20min，棄上清。6. 用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再次 4攝氏度， 10000g 離心20min ，棄上清。7. 用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。8 .粗制的樣品可于干冰 /乙醇中速凍，保存于 -80攝氏度。9）用特殊的去污劑選擇性的分離。 簡單，可靠，但有時含有其他蛋白。原理：4度時所有的蛋