基因敲除技術(shù)的運用 (1)

1、 蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院綜合能力訓(xùn)練文獻綜述題目：基因敲除技術(shù)研究進展 作者：蔣成 學(xué)號：201207749指導(dǎo)教師：謝放完成日期：2014-7-16基因敲除技術(shù)研究進展摘要：本綜述主要闡明基因敲除技術(shù)近幾年來的方法和步驟，以及在真核生物和原核生物中的具體實施，并運用實例形象闡明基因敲除技術(shù)的作用，以及其在國內(nèi)的發(fā)展和以后基因敲出技術(shù)的發(fā)展前景，和一些在運用基因敲除技術(shù)過程中的問題。關(guān)鍵字：基因敲除 原核中斷系統(tǒng) 真核中斷系統(tǒng) 絲狀真菌基因敲除1.引言：1.1概念：基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因

2、敲除的技術(shù)基礎(chǔ)1。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型2。直到現(xiàn)在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。2012年初的敲除決定表面抗原的豬的模型的成功建立更是為異種器官移植排除了一道重要的障礙，展示了基因敲除技術(shù)的美好前景?？傊? 基因敲除已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的最熱點與最前沿，并已對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響，成為革命性的研究工具, 具有極其重要的理論意義和實踐意義1,3。 基因敲除是借助分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和動物胚胎學(xué)的

3、方法, 通過胚胎干細胞2這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞, 藉以揭示基因功能最直接的手段之一, 因此成為后基因組時代的重要研究方法和內(nèi)容。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理3，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。1.2基本步驟：a.基因載體的構(gòu)建：目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體。b.ES細胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。而最常用的鼠的種系是129 4及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的

4、傾向， 是基因敲除的理想實驗動物。c.同源重組：把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的 DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如 neo基因，TK基因等)的載體上，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達。d.選擇篩選已擊中的細胞：一般地， 篩選使用正、負選擇法， 比如用 G418篩選所有能表達 neo 基因的細胞，然后淘汰所有 HSV -TK 正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。將篩選出來的靶細胞導(dǎo)入鼠的囊胚中， 再將此囊胚植人母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠2,6。e.表型研究：通過觀察嵌體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解

5、目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。f.得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。 1.3其他基因敲出技術(shù)1.3.1.條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法4。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre干預(yù)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)3。 1.3.2誘導(dǎo)性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除也是

6、以C re/lox p 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達的啟動子的活性或所表達的C r e 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利Cr e基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在1oxP 動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。1.3.3利用隨機插入突變進行基因敲除此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標(biāo)細胞基因組中進行隨機

7、插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞。2.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀2.1原核生物中基因敲除技術(shù)的應(yīng)用2.1.1基因敲除技術(shù)在絲狀真菌中的研究現(xiàn)狀 （1）載體構(gòu)建利用P C R技術(shù)輔助構(gòu)建打靶載體7可以快速獲得目的片段，即大腸桿菌質(zhì)?；?。 （2）載體中加入特殊的結(jié)構(gòu)元件或采用特殊的報告基因,在打靶載體中，加入非同重組選擇標(biāo)記是提高篩選效率的 一 種非常有效的方法. （3）構(gòu)建高同源重組率茵株等將粗糙鏈孢霉中與KU70、KU80(編碼與非同源重組有關(guān)蛋白質(zhì)的基因)同源 的兩個基因分別敲除，突變株的生長及產(chǎn)生的孢子都正常,但對于一些抗真菌藥物比

8、野生型菌株更加敏感對其進行基因打靶，轉(zhuǎn)化子的同源重組率達1005，而對照的野生菌株只有109，6309 5等確定了構(gòu)巢曲霉中與人KU70基因同源的基因，將之敲除后，菌株的生長和敏感性幾乎影響，但是同源重組率大幅度提高，90以上的轉(zhuǎn)化子在正確的位點具有單拷貝插入。結(jié)合異源標(biāo)記基因，建立了一個高效通用的構(gòu)巢曲霉基因打靶系統(tǒng) (4)其他農(nóng)桿菌的外源基因轉(zhuǎn)化是目前植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用比較廣泛的方法。1998年用農(nóng)桿菌干預(yù)轉(zhuǎn)化了等絲狀真菌，并證明異源的農(nóng)桿菌TDNA往往以單拷貝隨機地插入到絲狀真菌染色體中近，以宿主對比研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法與CaC1PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法4,7。2.1.2基因敲除技術(shù)在基因功能

9、和結(jié)構(gòu)方面的研究現(xiàn)狀作為研究基因功能和結(jié)構(gòu)的最直接最有效的方法之一，為從分子水平研究病原菌致病、耐藥機理，并為最終防治病害提供了強有力的手段。煙曲霉是曲霉屬中最常見的致病真菌，在免疫受損的患者中常引起有致命危險的侵襲性肺曲霉病。等研究了煙曲霉erg3A和erg3B兩個基因在固醇合成和對抗真菌藥物耐受性中的作用。分別敲除rg3A基因1,20、erg3B基因和將兩個基因共同敲除，結(jié)果顯示erg3B編碼C-5固醇脫氫酶，而erg3A對煙曲霉麥角固醇合成沒有明顯的作用，3種突變株對兩性霉素B，等抗真菌藥物的敏感性沒有改變L4。構(gòu)巢曲霉而被作為“模式”真核生物的一些丙酸鹽可以作為絲狀真菌的碳源，但是將它

10、添加到含葡萄糖的培養(yǎng)基時又抑制真菌生長。為解釋這一現(xiàn)象，人們對構(gòu)巢曲霉進行了研究，發(fā)現(xiàn)了檸檬酸甲酯循環(huán)。Brock等進一步研究了這一機制，他們從構(gòu)巢曲霉基因組序列中確定了上述循環(huán)中的一個關(guān)鍵酶異檸檬甲酯酸裂合酶的編碼基因，并將其敲除。得到的缺失株在以丙酸鹽為碳源的培養(yǎng)基上不生長，在以其它物質(zhì)為主要碳源且含有丙酸鹽的培養(yǎng)基上受抑制。由此推論，檸檬酸甲酯循環(huán)的產(chǎn)物異檸檬甲酯是潛在的細胞代謝毒物。2.1.3基因敲除技術(shù)在改良工業(yè)生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用現(xiàn)狀絲狀真菌與其它生產(chǎn)菌株相比有其獨特優(yōu)點，即具有很高的蛋白質(zhì)分泌能力；能正確進行各種翻譯后加工，包括肽鏈剪切等，且其糖基化的方式與高等真核生物的類似；絲狀真

11、菌如曲霉等作為生產(chǎn)菌株，已有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。但是絲狀真菌用作工業(yè)生產(chǎn)菌株也存在一些缺陷，例如對外源蛋白質(zhì)的表達量低，有的菌株會產(chǎn)生一些有害物質(zhì)影響產(chǎn)品品質(zhì)等。基因敲除技術(shù)無疑給基因工程育種提供了一個有效的途徑。孫晶等以潮霉素抗性基因為標(biāo)記，利用基因敲除技術(shù)將黑曲霉GICC2773中一種編碼天冬氨酸胞外蛋白酶的基因敲除，功能分析顯示突變株的酸性蛋白酶活性明顯下降，外源蛋白漆酶的分泌表達提高，提示基因的缺失對外源蛋白漆酶的表達有保護作用。2.1.4基因敲除技術(shù)次生代謝產(chǎn)物合成途徑改造中的應(yīng)用現(xiàn)狀絲狀真菌的許多次生代謝產(chǎn)物對人類的營養(yǎng)和健康有著非常重要的作用，如抗生素、stat類藥物、有機酸

12、、多不飽和脂肪酸等。利用基因敲除技術(shù)可以有目的地對次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑進行改造，使代謝向目的產(chǎn)物積累方向進行。2.1.5原核中斷系統(tǒng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀Red系統(tǒng)的機制：Red系統(tǒng)是原核中斷系統(tǒng)的代表,由噬菌體bet、gam3個基因組成,它們分別編碼Gam3蛋白質(zhì)。一種核酸外切酶,單亞基的分子量為24kDa,這種蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子,中間有一中空的通道,通道的一端可容納雙鏈DNA分子,另一端只可容納單鏈DNA。Ex蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端,從DNA雙鏈的5端向3端降解DNA,產(chǎn)生3突出端。Beta蛋白是一種退火蛋白,單亞基的分子量為25.8kDa。在溶液中,Beta蛋白自發(fā)地形成

13、環(huán)狀結(jié)構(gòu),緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3末端DNA被單鏈核酸酶降解, 同時干預(yù)互補單鏈DNA的退火雙鏈DNA退火完成后,Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來。Beta蛋白在Red同源重組過程中起著決定性的作且重組效率遠高于重組2.2真核生物中基因敲除技術(shù)的應(yīng)用將小鼠ESC中的卡巴B蛋白抑制因子的激酶2基因敲除16,獲得了雜合的IKK2突變體(IKK+/-2),雜合體在各個方面都是正常的, 通過雜合個體之間的交配, 研究者在很長時間內(nèi)未能得到該位點純合的個體,即 I KK- / -2 個體。在雜合狀態(tài)時IKK2的表達只是受到了影響,但依舊有表達,而一旦純合就意味著該基因的表達完全被中斷,或者說即便有表達

14、,表達出的蛋白質(zhì)也不再是正常的IKK2。隨后的研究表明,IKK-/-2屬致死基因型,該位點純合的個體在胚胎發(fā)育的早期(125135d)死亡。原因是當(dāng)無IKK2表達時,胎兒產(chǎn)生腫瘤壞死因子)引起早期胎兒的肝細胞發(fā)生大量凋亡,而在正常情況下,IKK2可抑制TNF引起的肝細胞凋亡。那么能否拯救這樣的純合子個體呢?通過IKK+/-2與TNF基因被敲除的雜合子小鼠交配,獲得了IKK+/-2/TNF+/-的個體,通過這種基因型的公母鼠的交配獲得了IKK-/-2和TNF-/-的個體。觀察表明,IKK/-2/TNF-/-的個體可以存活到出生,但出生后一月內(nèi)死亡6。將線性化的針對小鼠凝血因子IX基因2,6的敲除

15、載體用電穿孔法轉(zhuǎn)入小鼠ES細胞,經(jīng)G418篩選,用PCR和Southern雜交15的方法從具藥物抗性的細胞中篩選出4個凝血因子IX基因被定向敲除的ES細胞克隆,為進一步開展基因敲除研究打下基礎(chǔ)。采用PCR擴增的方法研究了從美國德克薩斯大學(xué)引進的熱休克因子1(Heatshockfactor1,HSF1)基因敲除小鼠的基因型。結(jié)果表明,采用PCR擴增的方法,野生型小鼠僅在562bp的位置出現(xiàn)一條帶,突變純合子則在377bp處出現(xiàn)一條帶,而突變雜合子則在562bp和377bp處出現(xiàn)兩條帶。構(gòu)建了可用于大鼠次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因敲除的載體。采用解剖學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)測定的方法研究了S

16、mad3基因敲除對小鼠腎功能的影響,結(jié)果表明,該基因敲除的純合小鼠125%的個體表現(xiàn)為單腎,表明Smad3基因?qū)π∈竽I臟的形成有一定的影響。3.影響因素：構(gòu)建特定基因的敲除載體必須深入了解該基因的結(jié)構(gòu)組成, 如組成該基因的核苷酸序列、 外顯子和內(nèi)含子數(shù)目、 特定位點的限制性內(nèi)切酶的種類以及該基因在染色體上的定位等。篩選發(fā)生了同源重組的干細胞的方法主要有以下三種。(1) southern雜交即用特定的限制性內(nèi)切酶消化從經(jīng)過擴增的干細胞中提取的基因組 DN A , 用敲除載體為探針, 對于發(fā)生了同源重組的干細胞克隆和隨機整合了敲除載體的干細胞克隆, 其 Southern雜交結(jié)果不同, 雜 交出的條

17、帶有差異。 (2) PCR 擴增采用在經(jīng)過改造的載體中插入一小段聚核苷酸 序列, 該序列正好與基因組基因上的小段序列組成一對P CR 引物, 這樣通過 PCR 擴增產(chǎn)物的大小即可區(qū)分同源重組和隨機插入。 (3) 正負選擇該方法篩選同源重組克隆的依據(jù)是對于線性化的外源基因片段無論采用電轉(zhuǎn)化還是顯微注射, 外源基因整合進宿主基因組時的方式多為兩頭插入, 根據(jù)這一現(xiàn)象 Mario設(shè)計了長度大于10 k b的載體, 其中包含 neo基因, 而在距離發(fā)生同源重組較遠的位置上有一個由單純皰疹病毒基因啟動子驅(qū)動的胸甘激酶基因( H S V t k ) 片段1,10。同源重組效率的因素主要是外源基因轉(zhuǎn)染的方式

18、。采用顯微注射的方法, 在經(jīng) G4 18 篩選出的克隆中,發(fā)生同源重組的概率 為1/ 15014, 而采用電轉(zhuǎn)化的方法時, 經(jīng)G418 篩選出的克隆中,發(fā)生同源重組的概率僅為 1/ 3 004。4.展 望：4.1基因敲出技術(shù)將對醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響,有著更加廣闊的應(yīng)用前景1,8,1018,19。4.2將來對時間和區(qū)域可控性的基因敲除大鼠兔豬以及和人類更為接近的猴的研究，將會成為遺傳工程中的另一重大飛躍，對疾病的分子機理研究和疾病的基因治療，藥物治療評估以及異種移植器官等有著重大的理論和實際意義。4.3基因敲除技術(shù)的缺陷隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但

19、基因敲除技術(shù)始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的13， 敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面，對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性4，也就無法對這些必需基因進行相應(yīng)的研究了。而這缺陷在未來一定會克服。4.4建立生物模型7。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進行相關(guān)的研究。這些模型可以是細胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。4.5疾病的分子機理研究和疾病的基因治療。

20、通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對機體的影響。這無論是對了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶標(biāo)都有重大的意義。4.6提供廉價的異種移植器官1,2。4.7免疫學(xué)中的應(yīng)用10。同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時或多或少會有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動物免疫分子基因敲除，換以人的相應(yīng)基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體的生產(chǎn)問題。4.8改造生物、培育新的生物品種1,8。細菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持。5.存在的問題：

21、（1）基因定向敲除的成功率很低, 檢測發(fā)生同源重組干細胞的工作比較困難。（2）盡管小鼠的繁殖周期為19到21d，但從定向敲除干細胞基因到篩選出具備理想基因型的基因敲除小鼠模型依舊耗時極長2,6。（3）基因敲除后的功能可能被其它基因的代償作用填補, 因此并不表現(xiàn)表型缺陷。6.結(jié)束語 基因敲出技術(shù)對人們具有很大的運用，不僅在植物，動物微生物都有巨大的運用，很大程度上可以造福人類，對人類具有重大的意義。然而基因敲出技術(shù)依然存在許多問題等待人們進一步解決和研究。參考文獻1王又紅. 基因敲除技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展前景J. 國外醫(yī)學(xué), 1999:26-5.2戴旭明,薛紅,楊樺,等.小鼠胚胎干細胞凝血因子IX基因的定向敲除J.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 1998, 19(1):1-14.3劉德培, 方福德. 基因敲除J.生理科學(xué)進展, 1995: 26-14yunfengli基因敲除技術(shù)的最新進展J 丁香園電子期刊,2003:125黃衛(wèi)，汪天虹，吳志紅，等絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系