2019年時間分辨熒光免疫分析法產(chǎn)前篩查原理與操作規(guī)程

1、時間分辨熒光免疫分析法產(chǎn)前篩查原理與操作規(guī)程一、產(chǎn)前篩查定義及其原理產(chǎn)前篩查（Prenatal Screening)是指通過經(jīng)濟(jì)、 簡便和較少創(chuàng)傷的檢測方法，從孕婦群體中發(fā)現(xiàn)懷有某些先天缺陷胎兒的高危孕婦，以便進(jìn)而進(jìn)行診斷，以最大限度地減少異常兒的出生。 血清學(xué)標(biāo)志物產(chǎn)前篩查已成為非侵入性產(chǎn)前診斷的重要方法。目前產(chǎn)前篩查的兩種主要疾病是唐氏綜合征（Downs Sydrome ，DS；又稱 21 三體綜合征）和胎兒神經(jīng)管缺陷（ Neural Tube Defects ，NTDs），也包括一部分 18 三體綜合征。產(chǎn)前篩查可以在妊娠早期 （ 7 13 周）或中期（14 21 周）進(jìn)行。目前用于產(chǎn)前

2、篩查的血清學(xué)標(biāo)志物有：甲胎蛋白（ AFP）、游離 -絨毛膜促性腺激素（ F- -hCG）、游離雌三醇（uE3）、妊娠相關(guān)血漿蛋白（PAPP-A）、抑制素 A（inhibin A）等。產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)測量通用評價指標(biāo)為中位值倍數(shù) （MOM），正常妊娠特定的 MOM=標(biāo)本檢測濃度 / 相應(yīng)孕周中位值濃度。 產(chǎn)前篩查系統(tǒng)由體外診斷試劑、檢測儀器和篩查分析軟件組成。 檢測儀器配合體外診斷試劑檢測出孕婦血清中標(biāo)記物（ AFP、F- -hCG、PAPP-A等）的濃度，將檢測數(shù)據(jù)及孕婦相關(guān)因素輸入篩查分析軟件中，即可得出唐氏綜合征（ DS）和神經(jīng)管缺陷（ NTD）篩查的結(jié)果。由于目前的技術(shù)水平的限制，產(chǎn)前篩查技

3、術(shù)都不能做到篩查 100%正確。假陰性病例因此會誤診，假陽性病例一般在產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)時被糾正。二、唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查唐氏綜合征是人類最常見的一種染色體病，發(fā)病率約 1/800 1/600 ，男性多于女性。 1866 年英國醫(yī)生 LangdomDown 首次對此病進(jìn)行臨床描述，因此命名，稱為 Down s Syndrome，簡稱 DS。1959 年 Lejeune 首先發(fā)現(xiàn)本病的病因是多了一條 21 號染色體，故又將其命名為21 三體綜合征。唐氏綜合征的主要臨床表現(xiàn)：嚴(yán)重智力低下、愚型面容，約50%伴有先天性心臟病、小頭畸形等發(fā)育異常。目前對 DS尚未有治療方法，因此通過產(chǎn)前篩查找出高危孕婦，對

4、其進(jìn)行產(chǎn)前診斷是防止患兒出生的重要手段。1. 以孕婦年齡作為篩查指標(biāo)最早用于 DS的篩查指標(biāo)為孕婦年齡。早期研究發(fā)現(xiàn)， DS的發(fā)病率隨孕婦年齡增高而增高， 1977 年 Hook 和 Chambers報道了孕婦年齡在 20 30 歲之間，發(fā)病率呈線性增加，而在 33 歲左右呈對數(shù)增加，孕婦年齡為 35 歲時，發(fā)病率約 1/384 ，40 歲時約 1/110 ，比 30 歲時增加了 8 倍，如圖 1。一般認(rèn)為 35 歲以上1的孕婦是 DS的高危人群，是要進(jìn)行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，若僅以孕婦年齡 35 歲作為篩查指標(biāo)， DS的檢出率約 20%，而約 80%的胎兒 DS 是在年齡小于

5、 35 歲的孕婦人群中。 因此，不少國家的篩查機(jī)構(gòu)指出 “ DS 產(chǎn)前篩查應(yīng)面向所有孕婦而不考慮年齡” 。僅用孕婦年齡指標(biāo)不夠全面，應(yīng)結(jié)合應(yīng)用孕婦血清標(biāo)志物指標(biāo)或超聲波形態(tài)學(xué)聯(lián)合篩查診斷。圖 1 孕婦年齡與胎兒發(fā)生唐氏綜合征風(fēng)險的關(guān)系2. 以孕婦血清標(biāo)志物為篩查指標(biāo)1984 年英國 Merkatz 等最先發(fā)現(xiàn)懷有DS胎兒的孕婦血清AFP含量降低，這在產(chǎn)前篩查史上是一個劃時代的進(jìn)步，建議將AFP 作為 35 歲以下孕婦胎兒DS的篩查指標(biāo)。這一發(fā)現(xiàn)很快被其它實(shí)驗(yàn)室證實(shí)， 1987 年 Bargot 發(fā)現(xiàn)懷有 DS胎兒的孕婦血清中的 hCG的水平是正常孕婦的 2 倍，以孕婦年齡再結(jié)合血清中 hCG

6、檢測，DS的篩查率可達(dá)到 63%。1988 年，Canick 等發(fā)現(xiàn)懷有 DS胎兒的孕婦血清中 uE3 的水平比正常孕婦低 25%。同年，倫敦 Bartholomews 醫(yī)院 Wald 提出 AFP、?-hCG、uE3 三聯(lián)的篩查方法。 1994 年美國婦產(chǎn)科學(xué)院向全美醫(yī)學(xué)界正式推薦這一組合，并得到廣泛應(yīng)用，一直至今。在上世紀(jì) 90 年代，有學(xué)者還相繼發(fā)現(xiàn)PAPP-A、 inhibin A、糖原抗原 125（CA-125）等與孕婦懷 DS胎兒有關(guān)。也將逐步應(yīng)用到 DS的產(chǎn)前篩查中。甲胎蛋白（ AFP）是胎兒血清中最常見的蛋白質(zhì)，1956 年由 Bergstrandh和 Czar 在人胎兒血清中

7、發(fā)現(xiàn)的一種甲種球蛋白。早孕期由卵黃囊產(chǎn)生，晚孕期由胎兒肝臟大量產(chǎn)生。胎兒血中的 AFP 經(jīng)排尿進(jìn)入羊水并通過胎盤屏障滲入母血。孕 10 周即可在母血中測出 AFP，孕 11 20 周 AFP濃度呈線性升高， 3234周（有文獻(xiàn)為2832 周）達(dá)到高峰，以后逐漸下降，分娩后幾天降為0。且孕早期以 AFP單項(xiàng)篩查胎兒染色體異常無意義，因此母血中AFP的檢測在孕中期21420 周進(jìn)行。正常孕婦血中AFP含量變化見圖2 與表 1。當(dāng)孕婦胎兒患 DS時，由于胎兒生長發(fā)育遲緩，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，合成 AFP能力降低，致使孕中期母血清 AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以

8、<0.4MOM或<0.7MOM為標(biāo)準(zhǔn)）。但當(dāng)胎兒出現(xiàn)開放性神經(jīng)管缺損或腹壁缺損時，破壞了阻止 AFP外溢的胎兒屏障，使胎兒體內(nèi)高濃度的 AFP釋放，滲透入母體循環(huán)，引起母體血清中的 AFP顯著升高。因此， AFP也可作為神經(jīng)管畸形的篩查指標(biāo)。正常妊娠母血中 AFP含量（ ug/L ）隨孕周的變化） 250.00L/200.00gu（ 150.00量 100.00含PFA50.000.0010152022242628303234363840孕周參考：馬云寶，顧軍，何雪云. 醫(yī)學(xué)特種檢測的臨床應(yīng)用，第1 版 . 北京：原子能出版社，1-2.圖 2 正常妊娠母血中 AFP含量變化趨勢表

9、1 正常妊娠母血清 AFP含量參考值（ ug/L ）孕周中位數(shù)0.4MoM 0.7MoM 2.0MoM 2.5MoM14-1541.2616.5028.8882.50103.1516-1754.1521.6637.91108.30135.3818-1969.2727.7148.49138.54173.1820-2191.5836.6364.11183.16228.9522-23127.6251.0589.33255.24319.0524-25155.1162.04108.53310.22387.7826-27190.3976.16133.27380.78475.9828-29252.80101

10、.13176.96505.60632.0030-31250.72100.29175.50501.44626.8032-33321.07128.43224.75642.14802.6834-35203.1681.26142.21406.31507.8936-37184.9273.97129.44369.84462.3038-39226.6890.67158.67453.35566.6940-42140.4156.1698.29280.82351.03摘自：方群 . 婦產(chǎn)科檢驗(yàn)診斷學(xué)，第1 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，62.絨毛膜促性腺激素（ hCG）是胎盤的合體滋養(yǎng)層分泌的一種糖蛋白，為胎盤中最

11、重要的激素， 由 和亞基組成， 兩個亞基可彼此結(jié)合， 也可游離于血液3中。孕婦血清中的 hCG主要以完整的形式存在，游離形式的 -hCG（ F- -hCG）占總 hCG的 18%。妊娠期母血清中 -hCG水平呈雙峰曲線，第 1 峰于妊娠 12 周前后（一般 810 周或 912 周），15 周后出現(xiàn)生理性下降， 20 32 周維持低而平穩(wěn)水平， 26 周達(dá)最低。第 2 峰于妊娠 37 周，明顯低于第 1 峰，至妊娠足月時稍有下降。在妊娠 11 周內(nèi)，血清 -hCG的含量與孕齡密切相關(guān)，隨妊娠進(jìn)展呈直線上升，孕齡每增加 1 天， -hCG平均增加 1.53IU/ml （hCG約每 1.3 天上升

12、 2 倍，如未達(dá)到此水平， 此次妊娠可能是輸卵管妊娠宮外孕， 應(yīng)動態(tài)觀察），分娩后急劇下降，產(chǎn)后 4 天降至 1 IU/ml ，產(chǎn)后 9 天基本消失。正常妊娠母血清hCG含量見表 2 與表 3。胎兒患 DS時，胎盤重量低于正常水平，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，因此孕婦血清中 hCG濃度下降要比懷正常胎兒的孕婦晚3 周左右，致使孕中期（約 20 周左右）母血清中的 hCG濃度呈高水平狀態(tài)， 懷 DS兒孕婦血清中游離的 -hCG濃度比正常孕婦至少高2 倍（一般 >2.5MOM），如圖 3。表 2正常妊娠母血清 hCG含量參考值（ U/L）妊娠期（周）受精后距末次月經(jīng)U/L2451

13、00352003000461000080000512714900005000001324152650008000026382740300015000摘自：周新，涂植光 . 臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)，第3 版 . 北京：人民衛(wèi)生出版社，435.表 3正常妊娠母血清 -hCG含量參考值（ mIU/ml）孕周 1-hCG孕周 2 -hCG孕周 2 -hC7 ±3304.92018568.7 ± 3718.22421001456146±24314.92118046.1 ± 6691.531065001548704.5 ± 3

14、3045.52220174.2 ±15022.346310001638275.4 ± 21572.42322282.3 ± 5493.35150100001729620.6 ± 11921.42416393.1 ± 4735.371000150001828100.5 ± 11952.82519403.9 ± 7825.39121200200001929392.4 ± 13482.82617455±9505.5摘自： 1. 韋振元等 . 血清 -hCG、 HPL和-hCG/HPL 比值對婦產(chǎn)科疾病的臨床意義

15、. 標(biāo)記免疫分析與臨床，1999，6（1）： 9-12.2. 王曉雯等 . 孕中期各周 -hCG正常值測定及其臨床意義. 中國優(yōu)生與遺傳雜志，2000，8（ 2）：62.4圖 3?-hCG在正常孕婦和懷有唐氏胎兒孕婦血清中的分布游離雌三醇（ uE3）是雌二醇（ E2 ）和雌酮（ E1）的代謝產(chǎn)物，在非妊娠女性中濃度很低，而在妊娠后期濃度則明顯增加。只有約9%的 E3 在血液循環(huán)中游離為 uE3。在妊娠后期 E3 由胎兒腎上腺、胎肝和胎盤大量合成，反映了胎兒和胎盤雙方面的功能。母體血清 E3 約 90%來自此合成途徑，少量由母體卵巢前體生成。E3 生物合成途徑的中斷將導(dǎo)致母體血清E3 低水平。造

16、成E3 途徑中斷的情況：胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、無腦畸形、胎盤硫酸酯酶缺乏、死胎、染色體異常等，缺乏E3 的孕婦分娩期將推遲。在胎兒正常發(fā)育的情況下，其母體內(nèi)uE3 含量自 2934周逐漸上升， 3536 周開始快速上升，在4142 周（ 3738 周或 4041 周）達(dá)高峰，正常妊娠孕婦uE3 參考值見表 4 與圖 4。uE3 被用于胎兒 DS篩查主要在孕中期，應(yīng)注意正常妊娠孕婦uE3 是孕中期變化最大的指標(biāo)，必須核對孕周。在孕婦懷DS 胎兒時，母體血清中uE3 表現(xiàn)為降低異常（一般 <0.7MOM）。目前 uE3 已是多標(biāo)記聯(lián)合篩查中用得相當(dāng)普遍的標(biāo)記物之一。表 4正常妊娠孕婦血清uE3

17、參考值 (±s, g/L)孕周例數(shù)FE孕周例數(shù)FE331762.2 ± 0.6302011.2 ± 2.718443.7 ± 1.1312312.3 ± 2.719344.8 ± 1.4322614.6 ± 3.520305.6 ± 1.5331621396.6 ± 1.8341122396.6 ± 1.835923418.0 ± 2.136915.2 ± 3.924338.3 ± 2.2371215.0 ± 4.225268.8 ± 2.038

18、1117.0 ± 3.726418.8 ± 2.6391324.7 ± 7.127298.8 ± 2.5401925.9 ± 8.628258.9 ± 2.4411036.9 ± 7.029279.6 ± 2.4引自：徐增秀, 徐燕紅 , 彭曉燕 ,等 .正常孕婦血清游離雌三醇動態(tài)監(jiān)測的臨床價值.標(biāo)記免疫分析與臨床,2000,7(2): 74-75.530uE3 25濃 2015 度 10g5/L017202326293639孕周圖 4 正常妊娠孕婦血清 uE3 含量變化趨勢妊娠相關(guān)血漿蛋白（ PAPP-A）是一種

19、大分子糖蛋白， PAPP-A 由胎盤合體滋養(yǎng)層和蛻膜產(chǎn)生，屬于2 巨球蛋白，具有激活補(bǔ)體，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。早在1974 年 Lin等首次報道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出 PAPP-A起源于絨毛周圍纖維蛋白，其水平隨孕周增加而增加。后來諸多學(xué)者分別在孕早期應(yīng)用PAPP-A結(jié)合 F- -hCG（或 hCG）作為 DS篩查指標(biāo)，證實(shí)PAPP-A是一種最有意義的標(biāo)志物。Wald 等及 Haddow等在綜合歸納了 9 個國家 21 個產(chǎn)前篩查診斷中心的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，用孕婦7 種血清標(biāo)志物以不同組合作篩查指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PAPP-A診斷 DS效果較滿意

20、，特別是結(jié)合F- -hCG 組合時陽性檢出率可達(dá)60%，其中假陽性率僅為5%。Zimmermann等檢測了 1151 例 21 三體和 18 三體患者的 PAPP-A水平，中位數(shù)的倍數(shù)分別是 0.51 和 0.08 ，結(jié)果顯示 PAPP-A可作為妊娠 DS胎兒產(chǎn)前篩查一個獨(dú)立的標(biāo)志物。孕早期就可以在母體血清中檢測到 PAPP-A（單胎受精后 32 天，雙胎受精后 21 天即可在孕婦血清中檢測到），隨著妊娠進(jìn)展，母體 PAPP-A水平升高，到妊娠足月時達(dá)到高峰，此時母血 PAPP-A濃度是羊水的 10 倍，產(chǎn)后 6 周即測不到。而整個妊娠期間，胎血中測不道 PAPP-A，這是因?yàn)?PAPP-A分

21、子量大，不能透過胎盤進(jìn)入血循環(huán)。 PAPP-A具有以下優(yōu)點(diǎn)：在孕早期階段，母血中即可測到。當(dāng)其他妊娠蛋白水平開始下降時，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一種在母血中濃度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。由于DS胎兒的器官包括胎盤均發(fā)育不全，胎盤合體滋養(yǎng)層功能下降，合成PAPP-A減少，因此懷有DS胎兒的孕婦，其血清中 PAPP-A一般低于 0.25MOM0.51MOM。在孕早期低水平的 PAPP-A是篩查染色體異常胎兒的很好指標(biāo)，尤其是 DS胎兒，陽性檢出率可達(dá)666。此外，有自然流產(chǎn)、異位妊娠、胎兒生長遲緩、胎死宮內(nèi)時，孕婦血清PAPP-A 亦呈低值，這與胎盤功能不全，使其合

22、成減少有關(guān)。正常妊娠孕婦血清PAPP-A參考值見表 5 與圖 5。該指標(biāo)在孕早期較為敏感，檢測PAPP-A前最好以 B 超檢查確定孕齡，孕14周后 21 三體妊娠與正常妊娠無明顯差別， PAPP-A的最佳篩查時間為妊娠1014周， <0.5MOM應(yīng)作產(chǎn)前診斷。 PAPP-A<0.5MOM也可見于胸腹腔積液、雙腎積水、腹水、羊水過多、死胎等；PAPP-A>2.5MOM可見于唇裂、尿道下裂等。表 5 正常妊娠孕婦血清 PAPP-A參考值（ mIU/ml ）孕周平均數(shù)中位數(shù)0.5 倍中位數(shù)2.5 倍中位數(shù)40.0080.0120.0060.03050.0740.0340.0170.

23、08580.7840.3210.1600.805114.9463.2691.6348.1731411.37410.8805.44027.2001716.25315.7837.89239.4582022.39221.92010.96054.8002326.07625.82012.91064.5502624.67426.63513.31866.5882930.36127.21013.60568.0253228.88829.54014.77073.8503535.10831.31015.65578.2753834.23337.36018.68093.4004131.76534.46017.23086

24、.150引自：章曉梅，李春華，馮懷英，等 . 孕婦血清 PAPP-A蛋白測定早期篩查染色體病 . 中國優(yōu)生與遺傳雜志，2001，9（2）：24-38.100.00080.00060.000系列 1系列 240.000系列 320.000系列 40.0004581114172023262932353841孕周注： 4-41 周孕婦血清 PAPP-A濃度曲線，系列1 為濃度平均數(shù)，系列2 為中位數(shù)，系列3 為 0.5 倍中位數(shù)，系列 4為 2.5倍中位數(shù)。圖 5正常妊娠孕婦血清PAPP-A含量變化趨勢7抑制素A（ inhibin A）被認(rèn)為是一個由合胞體滋養(yǎng)層產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，1992 年有學(xué)者開始

25、研究其與 DS胎兒的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)孕婦血清中與 DS胎兒相關(guān)的主要物質(zhì)是二聚體抑制素 A。Aitken 等研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠 78 周檢測二聚體抑制素 A，懷 DS胎兒的孕婦血清中二聚體抑制素 A 濃度較正常孕婦的高出 2 倍。進(jìn)一步結(jié)合 AFP、hCG能大大提高 DS的檢出率，在一些多標(biāo)記聯(lián)合篩查中發(fā)現(xiàn)其作用不可忽視，甚至超過uE3 的趨勢。糖原抗原 125（ CA-125） 為一種大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有爭議。 1990 年 Cherk 等報道孕早期孕婦血清中糖原抗原 125 水平高于正常值，可能與胎兒自發(fā)流產(chǎn)和 DS有關(guān)。 1997 年 Wenstrom 等用研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，

26、這一標(biāo)記在篩查 DS 胎兒時，其陽性率可達(dá) 45%，并認(rèn)為這一標(biāo)記可用于多標(biāo)記聯(lián)合篩查。三、胎兒神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查胎兒神經(jīng)管缺陷（ Neural Tube Defects ，NTDs）是出生缺陷最常見疾病類型之一，其發(fā)病是由于受精后 2024 天內(nèi)神經(jīng)盤折疊過程中神經(jīng)管不能閉合導(dǎo)致的。多數(shù)的神經(jīng)管缺陷是開放性的， 神經(jīng)組織完全暴露或僅僅蓋有一層薄薄的透明膜；只有極少部分損傷是閉合性的， 神經(jīng)組織由皮膚或一層很厚的膜完全覆蓋。無腦畸形、脊柱裂、腦膨出是神經(jīng)管缺陷三種主要類型。1977 年首次報道血清中 AFP水平升高和開放性神經(jīng)管缺陷畸形有關(guān)，因?yàn)殚_放性損傷時胎兒體內(nèi)高濃度的 AFP有可能通過

27、胎兒血液循環(huán)到達(dá)羊水， 再通過羊膜滲入母體循環(huán)， 引起母體血清中的 AFP顯著升高。因此通過檢測孕婦血清中AFP濃度可以進(jìn)行神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查，可以檢出 8090%的開放性神經(jīng)管缺陷。在英國，由于開展了神經(jīng)管缺陷胎兒血清篩查， 其神經(jīng)管缺陷胎兒的出生率從 1960 年的 1/350 降至 1987 年的 1/2500, 下降了 86。結(jié)果說明 AFP是一個很有效的神經(jīng)管缺陷篩查指標(biāo)（一般 >2.5MOM，它在篩查胎兒神經(jīng)管缺陷中的作用是其它標(biāo)志物無法替代的） 。四、 18- 三體綜合征的產(chǎn)前篩查18 三體綜合征可以用孕婦血清聯(lián)合篩查， 懷有 18 三體綜合征胎兒的孕婦孕中期血清 hCG

28、、AFP和 uE3 水平降低，以 AFP0.75MOM；hCG0.55MOM；uE30.60MOM為切割值， 18 三體綜合征胎兒陽性檢出率可達(dá)出 6080%。8五、產(chǎn)前篩查血清標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)前篩查各種不同血清標(biāo)志物篩查特性見表6。表 6各種不同血清標(biāo)志物篩查特性血清標(biāo)志物來源適用孕周陽性表現(xiàn)陽性檢出率篩查胎兒缺陷使用評價21 三體，作用肯定，AFP胎肝1521NTDs30%各種三體綜合征， NTDs普遍應(yīng)用作用肯定， -hCG胎盤82121 三體51%各種三體綜合征普遍應(yīng)用胎兒腎上腺，作用有爭議，uE3肝臟，胎盤142121 三體30%各種三體綜合征應(yīng)用較普遍作用肯定，PAPP-A胎盤合

29、體滋養(yǎng)層81421 三體54%各種三體綜合征普遍應(yīng)用胎盤合體滋養(yǎng)層，作用有爭議，INH A黃體142121 三體41%各種三體綜合征應(yīng)用漸增多21 三體綜合征：妊娠中期母血 AFP下降， uE3 下降， F- -hCG上升（三聯(lián)篩查方法）。PAPP-A 和 F- -hCG 在妊娠 10周左右有較大價值， PAPP-A 下降，F(xiàn)- -hCG上升，檢出率達(dá) 63%，這個組合已成為孕早期篩查最佳組合。 有學(xué)者認(rèn)為四聯(lián)篩查方法（ AFP，uE3，F(xiàn)- -hCG， INHA）的檢出率優(yōu)于三聯(lián)篩查方法。神經(jīng)管缺陷：孕早期母血AFP和 F- -hCG正常， PAPP-A下降；孕中、晚期PAPP-A明顯下降，

30、 AFP上升。18 三體綜合征（ Edward 綜合征）：PAPP-A和 F- -hCG 具有孕早期篩查18三體綜合征的價值，母血F- -hCG 和 PAPP-A下降；孕中期， 18 三體綜合征母血 AFP下降， uE3 下降， F- -hCG下降。13 三體綜合征（ Patau 綜合征）：血清標(biāo)志物變化與是否合并神經(jīng)管缺陷有關(guān)。Turner 綜合征：妊娠中期 uE3 下降， AFP改變不明顯或增高。如有胎兒非免疫性水腫 hCG上升，否則 hCG下降。染色體三倍體：當(dāng)為69 條染色體時，血清標(biāo)志物變化各不相同，一般認(rèn)為AFP上升， uE3 下降， F- -hCG或高或低。死胎：孕早期和孕中、晚

31、期死胎，母血F- -hCG和 PAPP-A均明顯下降（胎盤功能破壞），而 AFP升高（胎肝合成的AFP溢漏）。多胎： AFP、uE3、F- -hCG均升高。9六、產(chǎn)前血清標(biāo)志物篩查的影響因素影響血清標(biāo)志物的因素較多， 易造成假陽性或假陰性， 需采取措施予以糾正。1孕周估計誤差：妊娠周齡對篩查結(jié)果計算十分重要，計算方法有兩種：由末次月經(jīng)（ LMP）日期來推算，這種方法對月經(jīng)周期規(guī)律者較好，但對月經(jīng)周期不規(guī)則者不適用。超聲波測量胎兒的雙頂骨間徑 (BPD)是較正確的方法。當(dāng)兩種方法計算懷孕天數(shù)誤差超過 10 天時，則以 BPD為準(zhǔn)；不足十天的兩法均可。2. 多胎的影響：雙胎或多胎妊娠時，血清生化指

32、標(biāo)明顯高于單胎妊娠。雙胎的DS檢出率要低于單胎。3. 孕婦體重：孕婦體重過重由于稀釋作用可使 AFP、 uE3、hCG水平降低。4. 母親自身疾病：孕婦患有一些其他疾病時，可影響生化指標(biāo)。如孕婦為胰島素依賴性糖尿病時，母血清 AFP比正常同孕周孕婦低 20%，而 uE3 和 hCG水平升高。5. 母親吸煙：孕婦吸煙使 AFP升高 3%， hCG降低 3%，uE3 降低 23%。6. 種族差異：不同種族的人群正常值不同， AFP 在亞洲及黑人的水平較西班牙人和白種人高， hCG在非裔美國人中較高。因此，不同種族人群應(yīng)建立自己的正常值7. IVF 與自然妊娠相比， hCG明顯升高而 AFP明顯降低

33、。七、產(chǎn)前篩查流程產(chǎn)前篩查流程：（遺傳咨詢），收集資料，采集血樣，檢測，風(fēng)險評估，報告結(jié)果，病例追蹤，遺傳咨詢，存檔。如圖6、圖 7 與圖 8。圖 6產(chǎn)前篩查流程圖10圖 7 唐氏綜合征（ DS）產(chǎn)前篩查流程圖圖 8 神經(jīng)管缺陷（NTD ）產(chǎn)前篩查流程圖八、產(chǎn)前篩查時間分辨熒光免疫分析法實(shí)驗(yàn)操作常規(guī)1. 時間分辨熒光免疫分析法試劑盒檢測原理： 目前已應(yīng)用的有標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原（待測或標(biāo)準(zhǔn)品）競爭結(jié)合抗體的競爭法、固相抗原與游離抗原（待測或標(biāo)準(zhǔn)品）競爭結(jié)合標(biāo)記抗體的競爭法和固相雙位點(diǎn)夾心法等。 應(yīng)用較多的為固相雙位點(diǎn)夾心法， 如夾心一步法和夾心兩步法。 方法簡便，可以得到滿意的靈敏度和特異性，

34、批間批內(nèi)變異系數(shù)小，精密度高。 TR-FIA 夾心兩步法的檢測示意圖如圖 9。圖 9TR-FIA 夾心兩步法的檢測示意圖112. 時間分辨熒光免疫分析法實(shí)驗(yàn)室檢測流程： 如圖 10。采用 TRFIA 試劑二聯(lián)法 AFP+HCG（F- -HCG）報篩查項(xiàng)目及實(shí)告唐氏綜合征風(fēng)險率及神經(jīng)管缺陷的風(fēng)險率。驗(yàn)步驟簡介（詳見說明書）主要實(shí)驗(yàn)步驟試劑盒復(fù)溫標(biāo)記物的稀釋加樣加入標(biāo)記物工作液振蕩孵育洗滌反應(yīng)板加入增強(qiáng)液儀器檢測實(shí)驗(yàn)室檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制目的 :保證每個孕婦樣本的測定結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性手段 :1. 室間質(zhì)評系統(tǒng)誤差準(zhǔn)確度2. 室內(nèi)質(zhì)控隨機(jī)誤差精密度室內(nèi)質(zhì)控是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的基礎(chǔ), 提高常規(guī)測定工作

35、的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性?！笆覂?nèi)”質(zhì)控失控情況處理及原因分析1、填寫失控報告單上報實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人。2、由負(fù)責(zé)人作出是否發(fā)報告的決定。3、分析失控原因重做同一質(zhì)控物（人為差錯、偶然誤差）新開一瓶質(zhì)控物（質(zhì)控物使用、保管）重新校準(zhǔn)（校準(zhǔn)錯誤）進(jìn)行儀器維護(hù)，更換試劑（儀器、試劑）請專家?guī)椭?、完成失控報告單系統(tǒng)誤差原因分析1、樣本采集及方法或試劑分配器（加樣槍）不正確的調(diào)整；2、實(shí)驗(yàn)區(qū)域不恰當(dāng)溫度/ 濕度水平；3、試劑或校準(zhǔn)物批號改變；4、使用、保存或運(yùn)輸過程中試劑變質(zhì)；5、使用、保存或運(yùn)輸過程中校準(zhǔn)物變質(zhì)；6、使用、保存或運(yùn)輸過程中質(zhì)控物變質(zhì)；7、控制物非正確處理（冰凍）；8、在無霜冰箱中控

36、制無不恰當(dāng)?shù)谋４妫?、在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中使用非試劑級別的水；10、儀器濾光片輪臟或光源減弱；11、儀器設(shè)備近來校準(zhǔn)；12、實(shí)驗(yàn)操作人員變換。圖 10時間分辨熒光免疫分析法實(shí)驗(yàn)室檢測流程123. 儀器操作流程與注意事項(xiàng)儀器操作流程： 開機(jī)軟件注冊軟件登錄軟件使用 （進(jìn)入測試模塊選擇實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目新建測試板孔測試擬合分析） 退出軟件關(guān)機(jī)填寫 儀器操作記錄，具體操作如下：1. 打開半自動時間分辨熒光免疫分析儀 ( 后下方綠色按鍵 ) 儀器后面電源開關(guān)，再按下泰萊 -I 前面的白色按鍵啟動計算機(jī)。2. 打開半自動時間分辨熒光免疫分析儀右邊的測試電源開關(guān)( 綠色按鍵 )3. 打開電腦桌面 TALENT-I 圖標(biāo)，進(jìn)

37、入軟件登錄界面 .4. 在登錄界面中輸入登錄編號“ 1”，再輸入登錄密碼“ 1”.5. 在進(jìn)入半自動時間分辨熒光免疫分析儀軟件主界面后，按如下指示操作：屏幕顯示具體操作界面右邊顯示“測試，報告，質(zhì)控，點(diǎn)擊“測試”，進(jìn)入下一界面歷史，設(shè)置”界面左上方顯示編號，項(xiàng)目類型，項(xiàng)選擇項(xiàng)目類型和項(xiàng)目名稱后，進(jìn)入右邊新目名稱建測試界面，并選擇最后一塊板的結(jié)束孔如： 1. 類型：甲狀腺類2. 名稱： T3位，點(diǎn)“確定”，系統(tǒng)自動產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)批號和實(shí)驗(yàn)板號，點(diǎn)“板孔測試”界面右邊顯示您所要測試的藍(lán)色背點(diǎn)界面右下角的“測試” ，儀器開始測試，景試管擺放圖測試完后點(diǎn)“板孔設(shè)定”顯示“設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品”，“設(shè)定為質(zhì)填入試管擺

38、放起始位 . 如第幾排第幾管 . 若控”，“設(shè)定為樣品” .做曲線，需點(diǎn)擊“設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品”，并選好“復(fù)管數(shù)”；若做質(zhì)控，則點(diǎn)擊 “設(shè)定為質(zhì)控”并選好高，中，低三種類型 . 在“設(shè)定為樣品”一欄中，選好樣品的起始位置，輸入樣品數(shù)，用 1 到 N 表示 . 每完成一項(xiàng)請點(diǎn)擊“確定” .完成上述步驟后 , 點(diǎn)擊“擬合分析” ,在“使用自測標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行擬合或校準(zhǔn)”前界面右邊顯示有“擬合, 曲線 , 結(jié)果 ,打“” , 即可得到測試分析后的曲線, 點(diǎn)打印 , 保存” , 中下邊有“使用自測標(biāo)擊“擬合” , 得到測試濃度 , 要看曲線分析準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行擬合或校準(zhǔn)”情況 , 點(diǎn)擊“曲線” , 擬合得到結(jié)果后點(diǎn)擊“打

39、印”即可以打印測試結(jié)果.6. 上述操作全部完成后 , 點(diǎn)擊有整個界面右下角的 “退出” , 即可退出 TALENT-I軟件 .7. 關(guān)閉 TALENT-I 檢測儀電腦主機(jī)部分及顯示器的電源開關(guān) , 然后關(guān)閉測試電源開關(guān) , 最后關(guān)閉 TALENT-I 儀器的總電源開關(guān) .8. 填寫相關(guān)記錄。注意事項(xiàng)：按照上面規(guī)定的開機(jī)和關(guān)機(jī)順序進(jìn)行開關(guān)機(jī)，以免損壞設(shè)備； 進(jìn)13行具體的測量前，保證檢測儀部分開機(jī)預(yù)熱 30 分鐘以上；出現(xiàn)故障時可以參考“故障排除”一節(jié)的內(nèi)容進(jìn)行排除； 出現(xiàn)不能解決的問題時， 請及時與我公司售后服務(wù)部聯(lián)系。4. 實(shí)驗(yàn)操作與注意事項(xiàng)： 以 AFP和 F- -hCG為例，見下表 7。

40、1）. 資料收集常規(guī)資料收集是最關(guān)鍵基礎(chǔ)的一步， 直接影響檢測結(jié)果的分析。 完整的資料包括：孕婦姓名、出生日期、聯(lián)系地址電話、孕周、體重、末次月經(jīng)日期、月經(jīng)是否規(guī)則、是否吸煙、胰島素依賴型糖尿病、 曾出生先天愚型、 雙胞胎。還有采樣日期，因?yàn)榻^大部分是采用末次月經(jīng)來推斷孕周的。影響因素與建議： 對于月經(jīng)不規(guī)則的孕婦， 為了得到準(zhǔn)確的孕周信息， 要求其做 B 超確定孕周。 必須要有孕婦的簽名， 規(guī)避潛在的危險。 個體差異可能導(dǎo)致漏檢。2）.血樣采集常規(guī)采集時間：孕早期： 7-13 周；孕中期： 14-21 周。采集的量： 3-5 毫升靜脈血即可。標(biāo)本保存：分離血清，4可保存 5 天左右；條件允許

41、 -20 冷凍保存。影響因素與建議：（1）標(biāo)本中的 hCG隨時間延長和溫度增高會分解為 亞基和 亞基。由于游離的 亞基在血清中含量非常低，分解出來的 亞基會在很大程度上影響 亞基的檢測水平，而對完整的hCG的影響則相對較小。因此用 亞基作為指標(biāo)有可能增加假陽性率。為此實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)輸或保存標(biāo)本時要近量避免溫度的升高。有學(xué)者研究表明，30 6h 或 35 2h 即可使項(xiàng)目濃度明顯提高，血標(biāo)本應(yīng)及時分離（采用3000rpm 6min 以上或 2000rpm 15min），分析時室溫較高且標(biāo)本較多， 建議將標(biāo)本置于泠水浴中。（2）本試劑采用的是一步法，不能采用血漿標(biāo)本， EDTA、檸檬酸鹽等螯合劑會影響

42、銪標(biāo)記的穩(wěn)定性，使熒光值偏低。（ 3）標(biāo)本避免反復(fù)凍融，會使檢測物質(zhì)活性（效價）降低。對溶血、黃疸、脂血等標(biāo)本應(yīng)在報告單上注明， 特別含大量脂質(zhì)、 嚴(yán)重黃疸及溶血或加熱滅活之標(biāo)本均可能影響檢測結(jié)果， 可建議重新采血。 已稀釋的血清不宜存放， 稀釋樣本應(yīng)先加稀釋液，再加樣本，避免非特異性吸附。3 ）. 試劑準(zhǔn)備（1）微孔反應(yīng)板：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫（ 2025）。余下的微孔板條及時置入自封袋密閉并于 2 8保存。14（2）洗滌液：將 40ml 濃縮洗液和 960ml 蒸餾水在干凈的容器中混合， 作為工作洗滌液備用。蒸餾水敬請用戶自備。（3）標(biāo)記物工作液： 使用前配制， 將 h

43、AFP或 F-hCG標(biāo)記物與實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比 1：100 加進(jìn)潔凈的一次性容器中并混勻，當(dāng)次試驗(yàn)用完。影響因素與建議：（1）免疫反應(yīng)受溫度影響，在一定范圍內(nèi)隨溫度的提高，反應(yīng)加快。平衡溫度可保證實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的均一性。 （2）配置試劑采用去離子水或蒸餾水，避免酸、乙醇、螯合劑、氧化消毒劑等物質(zhì)混入。 （3）準(zhǔn)確配制洗液，洗液中 Tween20濃度高于 0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)測定下限。（ 4）標(biāo)記物工作液要在使用前配制，容器潔凈，充分混勻，避免水分揮發(fā)和污染（避免標(biāo)記物的揮發(fā)造成實(shí)驗(yàn)室污染 , 導(dǎo)致本底過高）。4）.加樣準(zhǔn)確吸取 25l的 hAFP或 F -hCG標(biāo)準(zhǔn)

44、品標(biāo)準(zhǔn)品（ Std ）、待測樣本 (Unk) ，依次加入微孔反應(yīng)板微孔中。影響因素與建議：（ 1）建議每次實(shí)驗(yàn)必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線， 待測樣本作復(fù)孔檢測。標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后2 8可以保存6 天；如長期保存請?jiān)?0存放，并避免反復(fù)凍融。（ 2）試劑要混勻，不可劇烈顛倒。加樣槍要定時校準(zhǔn)，在萬分之一天平上誤差 <10%。加樣槍按鈕壓至第一檔垂直握持，使吸嘴浸入液體，浸入深度:20ul和 10ul 1mm,100ul 2-3mm， 200ul和 1000 ul 2-4mm， 5000ul 3-6mm，10000ul 5-7mm，避免槍頭外殘留過多，導(dǎo)致結(jié)果偏高。加樣要準(zhǔn)確一致，不可產(chǎn)生氣泡、濺出，移液槍頭要一次性使用，避免交叉污染，干吸頭預(yù)先在血清中反復(fù)抽吸三次， 保證吸樣量準(zhǔn)確， 吸嘴要伸入反應(yīng)孔底部1/4-1/3處加樣，停靠5s，避免樣本在反應(yīng)孔上部滯留，導(dǎo)致非特異性吸附。使用連續(xù)加樣槍，按常規(guī)速度和程序，重復(fù)吸加10 次，計算誤差率50ulCV 1.5%， 100ulCV 1.0%，1000ulCV0.8%。定期進(jìn)行定標(biāo)，超標(biāo)時予以更換。5）. 加銪標(biāo)記物向每孔中加入 200l已配好的標(biāo)記物工作液，并加貼封片。影響因素與建議： 一定要貼加封片， 防止液體揮發(fā)和污染